林葉新，李忠海

1中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，長沙410004;2重慶大學生物工程學院，重慶400030

迄今為止，國內外實際使用的食品防腐保鮮劑仍以化學合成物為主，但近年來，發(fā)現化學合成類防腐保鮮劑會致畸、致癌或致突變，且對自然界的生態(tài)環(huán)境也會產生不利影響［1］。隨著人們安全、健康意識的提高，開發(fā)天然高效、安全無毒、廣譜的天然防腐保鮮劑受到普遍關注，成為食品科學研究和應用的一個熱點。

林檎葉作為我國廣西、湖南一帶民間茶飲，資源豐富，但利用率不高。目前我國分布的有尖嘴林檎［Malus mellina(Hana-Mazz)Rehd］和臺灣林檎［Malus formosana(Kawak＆Kooidz)Kawak］兩種［2］。林檎葉含有對人體健身、防癌、抗衰老、健齒等方面有益的保健成分及活性物質(包括黃酮類、酚類及皂苷類物質)，并具有抑菌、抗氧化等多種功效［3-6］。具有夏天用開水沖泡林檎葉，放置三天不餿，并長期不生長霉菌的特點;且每逢春節(jié)，經用水熬煮的林檎葉汁液浸泡的糯米核耙，可保存數月不變質［7］。因此，可針對林檎葉的以上功能進行深入研究，開發(fā)出新型的天然防腐保鮮劑，并廣泛應用于食品工業(yè)中。

林檎葉提取物一般所含活性成分較復雜，為了進一步探索其抑菌和清除自由基的作用機理，需對其開展進一步分離，并以分離物為受試物對進行研究，方能確定林檎葉提取物的防腐保鮮機理。本文利用不同的有機溶劑，對林檎葉水提取物進行萃取分離。按照極性由低到高的順序，用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，再用75%乙醇沉淀多糖和蛋白質，得到4種不同極性的組分，對其體外抑菌活性及清除DPPH的能力進行研究。為更好的確定林檎葉抑菌抗氧化機理提供一定的理論依據，促進林檎葉資源的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

尖嘴林檎鮮葉，于2008年9月采于廣西柳州融水縣。并由中南林業(yè)科技大學植物學教研室的彭映輝教授鑒定，剩余的試驗材料現存放于中南林業(yè)科技大學綠色食品研究所中，由李忠海教授管理。

1.1.2 試劑

DPPH試劑(95%，Lot No:K17Q036):Alfa Aesar，USA、Tris Base(BR)，VC(AR)，山梨酸鉀(市售食品添加劑)。

1.1.3 菌種

(1)細菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、變形桿菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphyloclccus aureus);(2)霉菌:黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Penicillium sp.)、毛霉(Mucor racemosus);(3)酵母:異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)、紅酵母(Rhodotorula)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。以上菌種均為中南林業(yè)科技大學發(fā)酵工程實驗室保存。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

所有配好的培養(yǎng)基，均需要經121℃高壓滅菌15 min后才能使用。(1)細菌培養(yǎng)基:牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂2%，水1000 mL，pH 7.4～7.6;(2)霉菌培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;(3)酵母培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏10.0 g，瓊脂2%，水1000 mL，pH自然。

1.1.5 儀器

LGJ-10真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);R201D-Ⅱ旋轉蒸發(fā)器(鄭州長城科工貿有限公司);LAC-5060S高壓滅菌鍋(DAIHAN LABTECH CO.，LTD.);PYX-280S-A生化培養(yǎng)箱(科力儀器);UV-1700紫外分光光度計(日本島津公司);UV-PROBE操作系統(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理

將清洗干凈的尖嘴林檎葉片，在40℃條件下進行熱風干燥，粉碎，過60目篩。

1.2.2 林檎葉水提物及其不同極性組分的制備［8］

取20 g粉碎好的林檎葉，按料液比1∶5的比例加入蒸餾水，60℃水浴浸提5 h，過濾。然后，將此部分提取物分成兩份，一份旋轉蒸發(fā)至浸膏狀，再冷凍干燥成粉，該組分為林檎葉水提物，標記為A;另一份倒入分液漏斗中，用等體積的乙酸乙酯，正丁醇各依次萃取3次，每次萃取2 h。正丁醇萃取后所得水層加乙醇至最終體積分數為75%，沉淀多糖和蛋白質，然后進行過濾。將所得的各組分分別進行旋轉蒸發(fā)去除溶劑，后轉溶于蒸餾水中，冷凍干燥得各萃取組分。林檎葉乙酸乙酯和正丁醇萃取，及75%乙醇沉淀物分別標記為B、C、D。過濾后所得的剩余物記為F。

1.2.3 管碟法檢測林檎葉水提物各萃取組分的抑菌作用［9-11］

往平皿中倒入20 mL配好的固體培養(yǎng)基，待瓊脂冷卻凝固后，取0.1 mL的菌懸液用涂布器均勻涂布在平皿瓊脂上，放置5 min后，用無菌鑷子攝取已干熱滅菌的牛津杯，呈對角放置4個滅菌牛津杯，在其中三個牛津杯中用無菌微量注射器順時針加入0.1 mL濃度分別為2.50、5.00和10.00 mg/mL的試樣(均由無菌蒸餾水配制)，另一個作為空白對照，加入無菌蒸餾水，用無菌濾紙蓋好。并以同樣的方法開展陽性對照試驗，山梨酸鉀的濃度為5 mg/ mL。細菌于37℃培養(yǎng)24 h，霉菌于28℃培養(yǎng)36 h，酵母于28℃培養(yǎng)24 h，每一菌種做3個平行試驗。培養(yǎng)結束后，測量形成的抑菌圈的直徑，統計林檎葉水提物及其不同極性組分的抑菌活性。

1.2.4 林檎葉水提物及其不同極性組分對清除DPPH的作用［12-15］

1.2.4.1 試劑配制

2.5 ×10-4mol/L，DPPH(95%乙醇配制，避光保存)，Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)

1.2.4.2 林檎葉各組分溶液的制備

用蒸餾水溶解林檎葉各組分，配成濃度為20.00 mg/mL的溶液，然后進行梯度稀釋2倍，得到20.00、10.00、5.00、2.50、1.25和0.63 mg/mL的受試物溶液。

1.2.4.3 Vc陽性對照溶液的制備

用蒸餾水溶解Vc，配制成濃度為0.4 mg/mL的溶液，之后進行梯度稀釋，共得到6個濃度的陽性對照溶液，分別為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025和0.0125 mg/mL。

1.2.4.4 試驗反應體系

對照組為1 mL試樣溶劑+2 mL DPPH+2 mL Tris-HCl緩沖液;對照空白組為1 mL試樣溶劑+2 mL 95%乙醇+2 mL Tris-HCl緩沖液;試樣組為1 ml試樣+2 mL DPPH+2 mL Tris-HCl(pH7.4);試樣空白組為1 mL試樣+2 mL 95%乙醇 +2 mL Tris-HCl緩沖液。在室溫下避光保存20 min，每個處理重復三次。將對照組進行光譜掃描，經掃描發(fā)現，羥自由基·OH模型組顯色產物最大吸收波長為524 nm，故選擇在524 nm下測定各組受試物的吸光。

1.2.4.5 數據處理方法

測出吸光度，按式清除率(%)={［(AC-Aj1) -(Ai-Aj2)］/(AC-Aj1)}×100%計算自由基清除率。式中:Ac為對照組吸光度;Aj1為對照空白組吸光度;Ai為試樣組吸光度;Aj2為試樣空白組吸光度。

2 結果與分析

2.1 管碟法檢測林檎葉水提物及其不同極性組分的抑菌作用

2.1.1 不同濃度林檎葉水提物及其不同極性組分對細菌抑制作用

如表1所示，林檎葉的A、B、C三個組分對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌有抑制作用，唯有C組分的最高濃度組對變形桿菌有輕微的抑制效果，即使是高濃度(10.00 mg/mL)的受試組，對變形桿菌的抑菌圈直徑仍小于8.00 mm。B組分抑菌效果最明顯，其高濃度(10.00 mg/mL)的受試組，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均＞12.00 mm。A、B、C三個組分對供試細菌的抑制效果由大到小為:B＞A＞C，表明，林檎葉的乙酸乙酯組分對供試細菌的抑制效果優(yōu)于其他組分。而與常用的食品防腐劑山梨酸鉀相比，在同樣劑量下，B組分對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制能力均不如山梨酸鉀強，但隨著濃度的增高，其抑菌能力增強。

表1 林檎葉水提物及其不同極性組分對細菌的抑制作用(±s)Table 1 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

表1 林檎葉水提物及其不同極性組分對細菌的抑制作用(±s)Table 1 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

注:空白對照無抑菌作用;表中數據為抑菌直徑(mm);“-”表示無抑菌圈;“*”表示此濃度下未測。下同。Note:Blank control didn’t show antibacterial activity;the data are the diameter of inhibition zone in the form(mm);“-”no inhibition zone，“*”this concentration didn’t be tested.The same below.

2.1.2 不同濃度林檎葉水提物及其不同極性組分對霉菌的抑制作用

如表2所示，林檎葉不同極性提取物中，對黑曲霉和毛霉有抑制作用的只有A、B、C三個組分，對青霉的抑制效果比較差，即使B組分在高濃度(10.00 mg/mL)時，對青霉的抑菌圈直徑＜8.00 mm。B組分抑菌效果最明顯，其高濃度(10.00 mg/mL)的受試組，對黑曲霉和毛霉的抑菌圈直徑均 ＞13.00 mm。A、B、C三個組分對供試霉菌的抑制效果由大到小為:B＞A＞C。這就說明，林檎葉的乙酸乙酯萃取物對供試霉菌的抑制效果比其他萃取組分更好。而陽性對照山梨酸鉀，在同等濃度下對三種霉菌均有明顯的抑制作用，且對黑曲霉和青霉的抑制能力，優(yōu)于林檎葉各部分的抑菌能力，但林檎葉B組分對毛霉的抑菌能力比山梨酸鉀強。

表2 林檎葉水提物及其不同極性組分對霉菌的抑制作用(±s)Table 2 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

表2 林檎葉水提物及其不同極性組分對霉菌的抑制作用(±s)Table 2 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

抑菌圈直徑Diameter of bacteriostatic ring(mm) 10.00 mg/mL 5.00 mg/mL 2.50 mg/mL黑曲霉Aspergillus niger供試菌株Strains樣品Sample A 13.36±0.18 9.37±0.03 6.92±0.12 C 7.01±0.18 － －D－－－8.93±0.01 6.90±0.04 B E － － －山梨酸鉀 * 11.10±0.10 *青霉Penicillium sp. A 6.80±0.03 － －B 8.13±0.03 6.07±0.01 －C－－－DE－－－－－－山梨酸鉀 * 9.57±0.15 *毛霉Mucor racemosus A 11.17±0.38 7.43±0.05 －B 18.43±0.41 14.33±0.10 9.92±0.01 C 8.01±0.02 6.02±0.02 D－－－E － － －山梨酸鉀 * 12.93±0.25*

2.1.3 不同濃度林檎葉水提物及其不同極性組分對酵母的抑制作用

如表3所示，陽性對照對三種受試酵母均有抑制作用。而林檎葉的不同極性提取物中，只有A、B、 C三個組分對啤酒酵母和紅酵母有抑制作用，對異常漢遜氏酵母菌的抑制效果不明顯，而山梨酸鉀在5.00 mg/mL下對異常漢遜氏酵母菌則非常顯著，唯有B組分的高濃度(10.00 mg/mL)受試組，對異常漢遜氏酵母菌的抑菌圈直徑＜7.00 mm，B組分抑菌效果最明顯，其高濃度(10.00 mg/mL)的受試組，對啤酒酵母和紅酵母的抑菌圈直徑均＞11.00 mm。A、B、C三個組分對供試霉菌的抑制效果由大到小為:B＞A＞C。由此可知，林檎葉的乙酸乙酯組分對供試酵母的抑制效果優(yōu)于其他萃取組分。且在同等濃度下，B組分對紅酵母的抑制能力與山梨酸鉀相當。

表3 林檎葉水提物及其不同極性組分對酵母的抑制作用(±s)Table 3 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

表3 林檎葉水提物及其不同極性組分對酵母的抑制作用(±s)Table 3 The bacteriostasis of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves(±s)

抑菌圈直徑Diameter of bacteriostatic ring(mm) 10.00 mg/mL 5.00 mg/mL 2.50 mg/mL異常漢遜氏酵母Hansenula anomala供試菌株Strains樣品Sample A － － －B 6.17±0.03 － －C－－－DE－－－－－－山梨酸鉀 * 12.20±0.26 *紅酵母Rhodotorula A 7.13±0.02 6.01±0.04 －B 11.53±0.41 8.82±0.05 6.11±0.08 C 6.16±0.11 － －D－－－E － － －山梨酸鉀 * 8.43±0.15 *啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae A 9.43±0.26 6.03±0.02 －B 12.01±0.21 8.13±010 6.08±0.03 C 6.30±0.01 － －D－－－E － － －山梨酸鉀 * 10.13±0.20*

2.2 林檎葉水提物及其不同極性組分清除DPPH的作用

由表4可知，林檎葉水提物及其不同極性的萃取組分中，各組分均具有一定的清除效果，且清除率與濃度呈顯著對數關系。由對數方程得到IC50值，由此看出林檎葉水提物及其各萃取組分對DPPH自由基的清除效果的強弱順序為:B＞A＞C＞D＞E。表明，林檎葉的乙酸乙酯萃取物清除DPPH的作用優(yōu)于其他萃取組分，并且其清除率與濃度呈顯著對數關系，y=0.1666 Ln(x) +0.6839，R2= 98.42%，IC50=0.33 mg/mL。而陽性對照Vc的對數方程為，y=0.2018 Ln(x) +0.8519，R2= 98.49%，IC50=0.17 mg/mL。雖然林檎葉乙酸乙酯萃取物的IC50值比Vc的高一倍，但也已在較低濃度下就顯現出清除自由基的作用。

表4 林檎葉水提物及其不同極性組分對DPPH的清除效果Table 4 Scavenging DPPH activities of the water extract and its different polarity fractions from M.mellina leaves

D沉淀部分 y=0.1469 Ln(x)+0.146 0.9651 0.63～20.00 11.13 E剩余部分 y=0.1224 Ln(x)+0.1232 0.9699 1.25～40.00 21.72 Vc y=0.2018 Ln(x)+0.8519 0.9849 0.0125～0.40 0.17

3 結論

林檎葉的水提物中含有黃酮類、酚類及皂苷類等活性物質，本研究通過常規(guī)的植物粗分離方法對其進行萃取，有效的將林檎葉的活性物質按照極性大小的不同進行分離后進行試驗。結果表明，林檎葉水提物(A)及其乙酸乙酯(B)、正丁醇組分(C)對供試菌種(大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉、紅酵母及啤酒酵母)均有抑制效果，有較廣譜的抑菌能力，與文獻報道基本一致［4，5］。黃衛(wèi)文等［6］主要是對林檎提取物體內抑菌作用的研究，與本文試驗方法不同。而鄧芳席等［4］是以林檎葉水浸出物和水提取液加95%乙醇沉淀去多糖的上清液為實驗對象，沒有對水提物按照極性大小進行分離。謝達平等［5］則是先用95%乙醇提取尖嘴林檎葉，再依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑對其進行處理，接著將得到的各組分及剩余的水相為試驗對象。這兩個研究報道在進行抑菌試驗時均沒有明確試樣的濃度［4，5］。本研究則分別使用三種濃度的試樣進行試驗，能為明確最佳抑菌濃度提供依據。同時，本研究發(fā)現林檎葉水提物的乙酸乙酯部分抑菌活性最強，并非如謝達平等［5］報道的抑菌部分在丁醇提取部位。此外本實驗還與常用食品防腐劑山梨酸鉀的抑菌效果作了比較，其中A、B、C三個組分大部分試驗結果與山梨酸鉀抑菌能力接近，且B組分對毛霉的抑制能力優(yōu)于山梨酸鉀。

另外，本研究還對林檎葉水提取及其不同極性組分的體外抑菌和清除DPPH的能力進行了比較。試驗表明，林檎葉水提物及其各萃取組分對DPPH均有一定的清除作用，并呈現出劑量依賴性，且乙酸乙酯萃取物對DPPH的清除能力最好。雖然文獻［6］報道過林檎葉不同極性提取物的抗氧化作用，但并沒有對林檎葉提取物清除DPPH的能力進行研究。因此，本研究結果對林檎葉提取物的抗氧化能力作了更進一步的補充。

本研究通過對林檎葉水提物的初步分離，可有效的將活性物質黃酮類及酚類物質富集起來，提高其抑菌及抗氧化的作用;而林檎葉水提物的乙酸乙酯組分，具備有明顯抑菌和抗氧化的能力，表明有望成為新型的天然防腐保鮮劑的原料。

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