杜 琨，陳錦屏

1陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安710062;2武警工程大學(xué)軍事經(jīng)濟(jì)系，西安710086

刺五加是五加科刺五加屬的重要的藥用植物之一，主要分布在我國(guó)吉林、黑龍江、遼寧等地。我國(guó)刺五加資源豐富，特別是長(zhǎng)白山地區(qū)因?yàn)榈锰飒?dú)厚的區(qū)域生態(tài)條件，為野生刺五加的生長(zhǎng)提供了良好自然環(huán)境［1，2］。刺五加果實(shí)是中藥中的上品，又為第三代果品，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥理活性，研究發(fā)現(xiàn)，刺五加果實(shí)含有皂甙、胡蘿卜素苷等多種生物活性成分［3-5］。近年來(lái)，皂甙因其具有良好的生物活性和多種藥理功效而備受關(guān)注，對(duì)其進(jìn)行合理開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。超聲提取主要是利用超聲波的攪拌效應(yīng)和空化效應(yīng)等加速活性成分的溶出，目前超聲提取技術(shù)在皂甙的提取工藝研究中得到廣泛應(yīng)用，但刺五加果實(shí)的超聲提取工藝未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)擬建立一種簡(jiǎn)便、快捷的長(zhǎng)白山野生刺五加果實(shí)總皂甙提取和測(cè)定方法，為野生刺五加新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究及深加工提供參考，以利于東北刺五加產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加果實(shí)，于當(dāng)年10月份采自吉林長(zhǎng)白山地區(qū)，經(jīng)陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院段玉峰教授鑒定為刺五加;齊墩果酸對(duì)照品(中檢所購(gòu)買);甲醇、乙醇、正丁醇、高氯酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器廠);電熱恒溫水槽(上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司);紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); ALPHA2-4冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Marin Chris公司)。

1.3 刺五加果實(shí)總皂甙提取工藝流程

刺五加果實(shí)→干燥→粉碎→超聲提取→提取液過(guò)濾濃縮→水飽和正丁醇萃取→清液蒸發(fā)濃縮→甲醇溶解定容至25 mL→稀釋后顯色測(cè)定含量

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.24 mg置于5 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即可。

1.4.2 供試品溶液的制備［6］

精密量取樣品1 mL，置于已處理好的樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，填充高度16 cm，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，乙醇裝柱，用水洗盡乙醇)，按3 M/min流速，以水70 mL洗脫;繼用70%乙醇洗脫，棄去初流出液5 mL，收集洗脫液50 mL，置水浴上蒸干。殘?jiān)约状既芙?，定量移? mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各60 μL，分別置于試管中，揮干，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，搖勻，置60℃恒溫水浴加熱10 min，取出試管置冰水浴中冷卻15 min，以溶劑60 μL同樣操作制備空白，于500～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。對(duì)照品溶液和供試品溶液在540 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，故選540 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3 線性關(guān)系考察

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.24 mg，置5 mL量瓶中加甲醇溶液并稀釋至刻度，搖勻。精密量取20、40、60、0、100、120 μL分別置于試管中，同樣操作，于540 nm處測(cè)定吸收度［6］，以刺五加皂甙含(ug)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.0032X+0.0158，R=0.9975

1.5 總皂甙得率的測(cè)定方法

精確稱取處理得到的樣品1 mL，用30%的乙醇溶解后，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法進(jìn)行操作，并以空白樣為對(duì)照，在540 nm出測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出刺五加總皂甙的得率(mg/g)。

1.6 提取條件的單因素試驗(yàn)

影響超聲提取野生刺五加總皂甙的因素很多，本試驗(yàn)因條件所限，選取料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)主要因素做單因素試驗(yàn)，考察它們對(duì)刺五加總皂甙的提取效果。

1.7 超聲波提取正交優(yōu)化條件試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選取料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，從中篩選出最佳工藝條件和技術(shù)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以刺五加標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0032X+0.0158，R=0.9975，其中y為吸光度為縱坐標(biāo)，X為刺五加皂甙質(zhì)量濃度(mg/mL)。

2.2 提取條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)超聲提取總皂甙得率的影響

在超聲功率400 W，提取溫度45℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間20 min的條件下，分別選取料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)料液比超過(guò)1∶20時(shí)，提取率增加平緩，說(shuō)明刺五加總皂甙基本溶出，再增加料液比，總皂甙得率變化不大，還會(huì)給后續(xù)的純化造成一定的困難，所以料液比選取1∶20。

圖1 料液比對(duì)粗提物中總皂甙得率的影響Fig.1 Effects of raw material-to-liquid ratio on the content of total saponins in crude extract

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波提取總皂甙得率的影響

在超聲功率400 W，提取溫度45℃，料液比1∶20，提取時(shí)間20 min的條件下，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，溶劑對(duì)總皂甙的提取效果最好。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%較為適宜。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗提物中總皂甙得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the yield of total saponins in crude extract

2.2.3 超聲功率對(duì)提取效果的影響

在提取溫度45℃，料液比1∶20，提取時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下，分別選取超聲功率150、250、350、450、550、650、750 W進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，總皂甙得率隨著超聲功率的增大而增加，但超聲功率增加到一定程度就會(huì)破壞總皂甙的結(jié)構(gòu)，反而不利于提取，因此選擇超聲功率為450 W。

圖3 超聲功率對(duì)粗提物中總皂甙得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of total saponins in crude extract

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在超聲功率450 W，提取溫度45℃，料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下，分別選提取時(shí)間10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，總皂甙得率呈遞增趨勢(shì)，這主要是由于超聲時(shí)間較短時(shí)，刺五加總皂甙不易溶出，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，總皂甙得率增加不明顯，綜合考慮超聲時(shí)間為40 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)粗提物中總皂甙得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of total saponins in crude extract

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件

選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，并以總皂甙得率為考察指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design experimental results

由正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析綜合分析可知，長(zhǎng)白山刺五加果實(shí)總皂甙超聲提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲波功率450 W、超聲提取時(shí)間50 min。各因素對(duì)總皂甙提取效果影響的權(quán)重依次為料液比＞超聲波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲提取時(shí)間。

3 結(jié)論

3.1 將超聲波提取應(yīng)用于長(zhǎng)白山野生刺五加果實(shí)中粗總皂甙含量的提取和測(cè)定，測(cè)得刺五加總皂甙含量為3.57 mg/g。如采用單純的溶劑浸提法測(cè)得總皂甙的含量為2.12 mg/g，因此超聲波輔助提取應(yīng)用于此效果良好。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果顯示各因素對(duì)總皂甙的提取影響順序依次為料液比＞超聲波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲提取時(shí)間。因此長(zhǎng)白山野生刺五加果實(shí)總皂甙提取的最佳工藝為料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲波功率450 W、超聲提取時(shí)間50 min。該提取方法簡(jiǎn)便、快捷，可用于長(zhǎng)白山野生刺五加果實(shí)總皂甙提取和測(cè)定。

1 Xiang YL(向亞林)，Ling B(凌冰)，Zhang MX(張茂新). Acanthopanax senticosus active constituents and biological activity research.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2005，17:246-249.

2 Meng FL(孟凡雷)，Chen RZ(陳瑞戰(zhàn))，Zhang M(張敏)，et al.Extraction and antioxidant activity of polysaccharides from acanthopanacis senticosi leaves.Food Sci(食品科學(xué))，2009，31:168-170.

3 Xu HY(許懷勇).刺五加中藥效成分的提取研究概況.China Modern Medicine Application(中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用)，2009，3(4):201-202.

4 Zhang W(張煒)，Liu BZ(劉寶珠).Progress in studies on pharmacological effect of Acanthopanax senticosus.J Shenyang Pharm Univ(沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2002，19:143-146.

5 Zhuang XP(莊向平)，Yang GS(楊更生).Acanthopanax senticosus active constituents pharmacological.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1992，23:122-146.

6 Bi SF(畢淑峰).The characteristics and medicinal value of Acanthopanax senticosus.Ecnomic Animal and Plant(經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物)，2004，8:896-901.

7 Zhang N(張娜)，Chen JP(陳錦屏)，Yan J(嚴(yán)靜)，et al.Process optimization for the ultrasonic extraction of total saponins from hetian-jadejujnhe.Food Sci(食品科學(xué))，2011，32:108-112.