李園園，李 錕，2，王俊霞，康文藝*

1河南大學(xué)中藥研究所，開封475001;2黃河科技學(xué)院，鄭州450063

朱砂根Ardisia crenata為紫金牛科紫金牛屬植物朱砂根或紅涼傘的根。其味苦、辛、性涼，具清熱解毒，散瘀止痛，祛風(fēng)除濕之功效，主治咽喉腫痛，扁桃體炎，心胃氣痛，勞傷吐血，跌打損傷，風(fēng)濕骨痛［1］。

朱砂根中含有三萜、酚、醌、強(qiáng)心苷、有機(jī)酸和黃酮類化合物［2］。研究多集中在朱砂根揮發(fā)性成分［3］。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)朱砂根具有止咳平喘，驅(qū)蟲和殺蟲［4］，抗炎抑菌、抗病毒［5］，抑制腫瘤生長等多種藥理作用［6，7］。Mi-BoKim［8］等的研究表明朱砂根水提物清除自由基的能力用抗壞血酸當(dāng)量表示為2.01±0.03(mmol/g)，40%乙醇提取物用Trolox當(dāng)量表示為9.45±0.15(mmol/g)。但未見朱砂根不同溶劑萃取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性的研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朱砂根于2007年10月采集于貴州省都勻地區(qū)。經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉凡教授鑒定為紫金?？谱辖鹋僦参镏焐案?Ardisia crenata)，標(biāo)本存于河南大學(xué)中藥研究所。

α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase，EC 3.2.1.20); 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopy ranoside，PNPG，026K1516);對硝基苯酚(4-Nitrophenol，PNP，10116387);阿卡波糖 (Acarbose，Lot 16869)和二甲亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。DPPH(日本東京化成工業(yè)株式會社);Fe3+-三吡啶三啞嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ;比利時Acros organics公司);［2，2'-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽］(ABTS，美國Fluka公司);6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸 (Trolox，美國Aldrich公司);丁基羥基茴香醚(BHA，比利時Acros organics公司);二丁基羥基甲苯 (BHT，比利時Acros organics公司)。

1.2 主要儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀 (美國Thermo Electron公司);LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH計 (美國Mettler-Toledo公司);電子天平(美國Mettler-Toledo公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司);UV-2000型紫外可見分光光度計(上海尤尼科儀器有限公司)。

1.3 朱砂根活性成分的提取

朱砂根干燥、粉碎后，用甲醇室溫下浸泡3次，每次4 d。合并提取液后濃縮，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到朱砂根石油醚(ACPE)、乙酸乙酯(ACEA)和朱砂根正丁醇(ACBU)部位。提取率分別為 0.98%、1.14% 和0.65%。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

利用本課題組建立的方法［9］。配制一系列對半稀釋的朱砂根提取物濃度的樣品，反應(yīng)體系為8 μL一定濃度的樣品，加入112 μL磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)，再加入20 μL 0.2 U/mL α-glucosidase，37℃恒溫15 min后加入2.5 mmol/LPNPG 20 μL，37℃恒溫反應(yīng)15 min。再加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波長下測OD值。計算抑制率，并用origin軟件求出相應(yīng)IC50值。樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式為:I% =［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5 抗氧化活性測定方法

1.5.1 DPPH方法

按照文獻(xiàn)［10］，將樣品和陽性對照品用甲醇配制成濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.1 mL樣品和陽性對照品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L)，混合30 min后測定515 nm處吸光度。每份樣品和陽性對照品平行操作3次，取平均值，計算出清除率，并計算出半數(shù)抑制率IC50值。樣品對DPPH自由基清除率的計算公式為:I% = ［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5.2 ABTS方法

按照文獻(xiàn)［11］，配制ABTS自由基工作液。將樣品和陽性對照品用甲醇配制成濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.15 mL樣品和陽性對照品加入2.85 mL ABTS自由基工作液，混合，放置10 min后，在734 nm處測定吸光度。每份樣品和陽性對照品平行操作3次，取平均值，計算出清除率，并計算出半數(shù)抑制率IC50值。樣品對ABTS自由基清除率的計算公式為:I% =［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5.3 FRAP方法

按照文獻(xiàn)［12］，將樣品用甲醇和陽性對照品配制成濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.2 mL樣品和陽性對照品加入3.8 mL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻后37℃反應(yīng)30 min后測定593 nm處吸光度，每份樣品和陽性對照品平行操作3次。取平均值，計算出清除率，結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示，即每克樣品的自由基清除能力相當(dāng)于Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(shù)(單位為μmol/g)。

1.5.4 半數(shù)清除率的計算

半數(shù)清除率(IC50)指清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，根據(jù)不同濃度抗氧化劑的清除率作曲線求出。

2 結(jié)果與討論

2.1 朱砂根提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

在相同濃度下，朱砂根3個部位對α-葡萄糖苷酶抑制活性從大到小依次為乙酸乙酯部位(IC50= 75.62 μg/mL)＞正丁醇部位(IC50=76.92 μg/mL)＞石油醚部位(IC50=89.85 μg/mL)，均遠(yuǎn)大于陽性對照藥Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)，從提取率和抑制活性大小兩方面考慮，乙酸乙酯提取物最適合開發(fā)成α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖1 朱砂根不同提取部位質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響。Fig.1 The mass concentration of the different extracts of A.crenata effect on α-glucosidase inhibitory activity

圖1顯示，朱砂根不同部位對α-葡萄糖苷酶抑制活性均呈劑量依賴性，而且，當(dāng)抑制率達(dá)到一定程度時，再增加部位質(zhì)量濃度，抑制活性不再增加。朱砂根乙酸乙酯部位和石油醚部位在質(zhì)量濃度為187.5 μg/mL時其對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到最高值，再增加濃度其抑制率不再增加，而正丁醇部位在質(zhì)量濃度為187.50 μg/mL時其對α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到81.38%，隨后濃度增加抑制率略有下降，說明正丁醇部位對α-葡萄糖苷酶抑制作用已達(dá)到飽和。

2.2 朱砂根抗氧化活性

2.2.1 對DPPH自由基的清除作用

由表1看出，朱砂根的乙酸乙酯和正丁醇部位均有清除DPPH自由基的作用，其中乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力最強(qiáng) (IC50=38.55 mg/ L)，比陽性對照BHT(IC50=18.92 mg/L)低約1/ 2，其次是正丁醇部位。但兩者均小于陽性對照BHA，且均約為其清除能力的1/13，石油醚部位在表2中未列出。在對朱砂根石油醚部位進(jìn)行DPPH自由基清除能力的初篩中，測定朱砂根石油醚部位質(zhì)量濃度在55.56 mg/L時，清除率為50.55%。

表1說明，朱砂根3個部位和陽性對照BHA、BHT對DPPH自由基的清除能力順序為:BHA＞BHT＞ACEA＞ACBU＞ACPE。

2.2.2 對ABTS自由基的清除

表2顯示，朱砂根乙酸乙酯和石油醚部位對ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)(IC50=3.60 mg/L和3.61 mg/L)，超過陽性對照BHT(IC50=7.44 mg/ L)的清除能力，均約為BHT作用的2倍，比BHA( IC50=1.74 mg/L)的作用弱，約為BHA作用的1/ 2。朱砂根3個部位和陽性對照BHA、BHT對ABTS自由基的清除能力順序為:BHA＞ACEA＞ACPE＞BHT＞ACBU。

表1 朱砂根不同提取部位的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of the different extracts of Ardisia crenata

2.2.3 對Fe3+的還原能力

表2顯示，朱砂根乙酸乙酯部位(FRAP=512.99±6.80 μmol TE/g)還原Fe3+的能力最高，接近陽性對照BHT(FRAP=1581.68±97.41 μmol TE /g)作用的1/3，其次為石油醚部位(FRAP=447.65 ±6.41 μmol TE/g)，約為BHT(FRAP=1581.68 ±97.41 μmol TE/g)的1/4，正丁醇部位(FRAP= 295.12±4.45 μmol TE/g)還原Fe3+的能力最低，約為陽性對照BHT(FRAP=1581.68±97.41 μmol TE/g)作用的1/19。3個部位還原Fe3+的能力均低于陽性對照BHA(FRAP=6633.04±114.04 μmol TE/g)。

朱砂根3個部位和陽性對照BHA、BHT對Fe3+的還原能力順序為:BHA＞BHT＞ACEA＞ACPE＞ACBU。

3 結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)朱砂根具有α-糖苷酶抑制活性，同時評價了其不同溶劑萃取部位的抗氧化活性，其中，乙酸乙酯部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性最好，并且提取率相對較高，因此具有非常好的開發(fā)價值。

1 The Editorial Committee of(Chinese Herbals)，State Administration of Traditional Chinese Medicine(國家中醫(yī)藥管理《中華本草》編委會).Chinese Herbals(Miao medicine) Vol.Guiyang:Guiyang Science and Technology Press，2005.267-269.

2 Chen SX(陳尚钘)，Hu WJ(胡文杰)，Huang YL(黃艷麗)，et al.Preliminary analysis on chemical compositions of Ardisia crenata Sim s’s.Anhui Agri Sci Bull(安徽農(nóng)學(xué)通報)，2007，13(18):152-153.

3 Liu XY(劉曉燕)，Wang R(王瑞)，Study on extraction of chemical constituents with supercritical CO2fluid from Ardisia crenata Sims and its analysis by GC-MS.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2008，19:2738-2739.

4 Jin ZJ(靳志娟).Chemical constituents and pharmacological research of Ardisia.J Pract Med Tech(實用醫(yī)技雜志)，2008，15:3432-3436.

5 Tian ZH(田振華)，He Y(何燕)，Luo HM(駱紅梅)，et al.Antibacterial and anti-inflammatory effects of Aradisia create Sims.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，1998，13:109-110.

6 Shen X(沈欣).Studies on antineoplastic active components in Ardisia crenata Sims.BeiJing:Beijing University of Chinese Medicine(北京中醫(yī)藥大學(xué))，PhD.2006.

7 Liu D(劉岱)，Wang NL(王乃利)，Zhang X(張雪)，et al.Study of anti-tumor effect from Ardisia crenata..第七屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集.2004，142-150.

8 Kim MB，Park JS，Lim SB.Antioxidant activity and cell toxicity of pressurized liquid extracts from 20 selected plant Species in Jeju，Korea.Food Chem，2010，122:546-552.

9 Kang WY(康文藝)，Li CF(李彩芳)，Song YL(宋艷麗).α-Glucosidase inhibitors from Luculia pinciana.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34:406.

10 Kang WY(康文藝)，Li CF(李彩芳)，Song YL(宋艷麗).Antioxidant xanthones from Securidaca inappendiculata.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2008，33:1982-1985.

11 Kang WY，Li CF，Zhang L.Antioxidant phenolic compounds and flavonoids of Mitragyna rotundifolia(Roxb.)Kuntze in vitro，Med Chem Res，2010，19:1222-1232.

12 Kang WY，Wang JM.In vitro antioxidant properties and in vivo lowering blood lipid of Forsythia suspense leaves.Med Chem Res，2010，19:617-628.