許芹永，朱靖博，2*，王振中，肖 偉

1大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;2大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，大連116034;3江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港222001

肉桂為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹(shù)皮，其性味辛、甘、大熱，具有補(bǔ)火助陽(yáng)，引火歸源，散寒止痛，活血通經(jīng)之功效［1］。肉桂的主要成分為桂皮醛、肉桂酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮酯、肉桂醇、香豆素等。此外，尚含膽堿、β-谷甾醇、原兒茶酸、鞣質(zhì)、水芹烯、丁香油酚等［2，3］。肉桂中含揮發(fā)油1%～2%左右，胥新元等［4］研究表明，肉桂揮發(fā)油具有降血糖的作用，故可對(duì)肉桂揮發(fā)油部分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以期獲得活性更高的單體化合物。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，α-葡萄糖苷酶抑制劑已被第三次亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的一線(xiàn)藥物［5］。醫(yī)學(xué)界已將α-葡萄糖苷酶抑制劑列為第3類(lèi)口服降糖藥［6］，如由德國(guó)拜耳公司研制的阿卡波糖在臨床上已被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治。但是由于阿卡波糖能夠引起某些嚴(yán)重的副作用，以α-葡萄糖苷酶為靶分子，從中藥中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為一個(gè)世界性的熱點(diǎn)［7-11］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選普遍采用分光光度法作為檢測(cè)手段，但試劑消耗大，且重現(xiàn)性差，尤其對(duì)復(fù)雜樣品或有顏色干擾的樣品，假陽(yáng)性高［12］。因此，本研究首次利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)結(jié)合體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選模型，從肉桂的石油醚活性部位追蹤分離，得到2個(gè)具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性單體。

1 儀器與材料

500 MHz AVANCE型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司;Spectrum One-B型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)鉑金埃爾默公司;UltiMate 3000高效液相色譜分析儀，美國(guó)DIONEX公司;微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司;HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;SK-1型快速混勻器，常州國(guó)華儀器有限公司。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20，面包酵母，純度≥10 U/mg)，sigma公司;對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，PNPG，純度 99%，sigma公司;對(duì)-硝基酚，PNP，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白，BSA，純度≥95%，sigma公司;阿卡波糖，Acarbose，50 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司;柱色譜和薄層色譜用硅膠，購(gòu)自青島海洋化工廠(chǎng)。肉桂于2010年10月購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為Cinnamomum cassia Presl的干燥樹(shù)皮。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制劑活性組分的跟蹤分離

干燥肉桂2 kg，粉碎后，用石油醚加熱回流提取3次，每次3 h，過(guò)濾，回收濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到石油醚提取物(Cp，35.7 g)。利用體外篩選模型，對(duì)Cp進(jìn)行酶活測(cè)試，Cp對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并且高于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖，所以采用活性追蹤方式對(duì)Cp進(jìn)行追蹤分離。

將Cp經(jīng)過(guò)200～300目硅膠柱色譜，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1～1∶1)，得到5個(gè)部分，其中第2部分(Cp-2，6.8 g)和第3部分(Cp-3，2.4 g)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。Cp-2部分經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1～7∶3)，得到化合物桂皮醛(2.8 g，1)。Cp-3部分經(jīng)硅膠柱色譜，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶0～1∶1)，以TLC檢測(cè)合并，再經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯洗脫(9∶1)，石油醚-乙酸乙酯重結(jié)晶，得到化合物肉桂酸(230 mg，2)。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的篩選方法

2.2.1 檢測(cè)方法

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，反應(yīng)體系參照朱文佳［13］所建立的體外α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型，并在其基礎(chǔ)上加以?xún)?yōu)化改進(jìn)，按照下式計(jì)算抑制率，并用Origin軟件求出相應(yīng)IC50值。

式中，A為不加待測(cè)樣品的PNP濃度(扣除相應(yīng)空白，mmol/L);B為加入待測(cè)樣品后PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白，mmol/L)。

色譜條件:Sino Chrom ODS-BP色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，大連依利特分析儀器有限公司);流動(dòng)相:A為乙腈，B為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為:0～8 min，20% ～30%A;8～13 min，30%～80%A;13～18 min，80% ～20%A;18～28 min，20%A);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:常溫;檢測(cè)波長(zhǎng):315 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

根據(jù)采用的反應(yīng)體系，精確稱(chēng)取0.0209 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液，超聲溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成6 mmol/L的PNP母液，將其稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025 mmol/L。分別取7個(gè)不同濃度的PNP溶液各80 μL，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，用超純水稀釋至500 μL，混勻，過(guò)0.45 μm濾膜，HPLC檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm。以PNP峰面積為縱坐標(biāo)，PNP濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)在1.5 mL離心管中進(jìn)行，根據(jù)所采用的反應(yīng)體系(總體積為160 μL):25 μL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液、5 μL 10 mg/mL待測(cè)樣品，30 μL 0.1 U/ mL α-葡萄糖苷酶，震蕩混勻，37℃孵育20 min，加入20 μL 4.0 mmol/L PNPG開(kāi)啟反應(yīng)，震蕩混勻，37℃反應(yīng)30 min后，加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，加超純水稀釋至500 μL，震蕩混勻，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后，用HPLC檢測(cè)，通過(guò)產(chǎn)物PNP的濃度變化，計(jì)算α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酶活力單位定義:37℃，pH 6.8條件下，每分鐘水解底物所產(chǎn)生1 μmol PNP的酶量，規(guī)定為1個(gè)酶活力單位(U)［13］。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色油狀物，UV λmax(MeOH)nm: 225，289。IR νmax(KBr)cm-1:2926，2740～2854，1679，1626，973，748，689。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.72(1H，dd，J=8.0，16.0 Hz，H-2)，7.42～7.58(6H，m，H-3，5，6，7，8，9)，9.70(1H，d，J= 7.65 Hz，H-1)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:128.5 (C-5，C-9)，128.6(C-7)，129.1(C-6，C-8)，131.2 (C-4)，134.0(C-3)，152.7(C-2)，193.6(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，故確定1為反式桂皮醛。

化合物2 白色粉末，mp.133～134℃。UV λmax(MeOH)nm:223，278。IR νmax(KBr)cm-1:2614～3025，1683，1631，766，705。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.46(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.40(3H，m，H-6，7，8)，7.55(2H，m，H-5，9)，7.80(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:117.3 (C-7)，128.4(C-5，C-9)，129.0(C-6，C-8)，130.8 (C-4)，134.1(C-3)，147.1(C-2)，172.2(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，故確定2為反式肉桂酸。

3.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選

從肉桂石油醚提取物Cp中分離得到5個(gè)部分，篩選發(fā)現(xiàn)第2部分和第3部分為活性部分，從中繼續(xù)分離得到2個(gè)活性化合物。從表1可以看出，2個(gè)化合物初篩抑制率均高于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖，而IC50均遠(yuǎn)小于阿卡波糖，具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

康文藝等［16］利用UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在405 nm測(cè)得阿卡波糖體外抑制α-葡萄糖糖苷酶活性的IC50值為1081.27 μg/mL。該研究選擇的保溫時(shí)間(15 min)、反應(yīng)體系總體積(160 μL)、檢測(cè)儀器和波長(zhǎng)(405 nm)等與本研究不同，但阿卡波糖的IC50值很接近，表明本研究利用的篩選模型及檢測(cè)方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠。

表1 不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1 α-Glucosidase inhibitory activity of extracts and compounds of C.cassia

3.3 受試化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

受試化合物不同質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響如圖1所示，2個(gè)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性均與濃度呈正量效關(guān)系，即劑量依賴(lài)性，抑制活性隨著受試化合物質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)，并且1的活性稍高于2。

圖1 受試化合物質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 The mass concentrations of compounds effect on inhibitory activity of α-glucosidase

3.4 受試化合物抑制類(lèi)型的確定

2個(gè)化合物分別取合適的2個(gè)不同濃度，PNPG取5個(gè)不同濃度，分別測(cè)定反應(yīng)速度。按 Lineweave-Burk作圖法，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)(［S］為底物濃度，V為反應(yīng)速度)，繪制2個(gè)化合物的抑制動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(圖2～3)，得到α-葡萄糖苷酶的Km的值為1.06 mmol/L。

從圖2和3可以看出，化合物1和2對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，反應(yīng)速度Vmax隨著受試化合物濃度的增大而變小，米氏常數(shù)Km保持不變［17］。根據(jù)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程［16］: 1/V'max=1/Vmax(1+［I］/Ki)，可以求出2個(gè)化合物的Ki值分別為178.07 μg/mL和229.43 μg/mL。

4 結(jié)論

本研究首次采用以HPLC作為檢測(cè)手段的α-葡萄糖苷酶抑制活性體外篩選模型，對(duì)肉桂石油醚提取物進(jìn)行活性追蹤分離，得到2個(gè)活性單體化合物，活性遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖?；衔?和2對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用均屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型，說(shuō)明它們既可以和酶結(jié)合，也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，從而降低酶活性，實(shí)現(xiàn)降血糖的作用。

1 National Pharmacopoeia Committee(國(guó)家藥典委員會(huì)).Chinese pharmacopoeia中國(guó)藥典(一部).Beijing:Chemical Industry Press，2005.91-92.

2 Xiao PG(肖培根).New journal of Chinese Materia Medica (新編中藥志，第三卷).Beijing:Chemical Industry Press，2002.576-579.

3 Song LR(宋立人).Textual research on Cinnamomum Eassia Blume.J Nanjing Univ TCM(南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2001，17(2):73-75.

4 Xu XY(胥新元)，Peng YM(彭艷梅)，Peng YG(彭源貴)，et al.Experimental studies on hypoglycemic effects of Cinnamon essential oil.Chin J Info TCM(中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志)，2001，8(2):26.

5 Gu JF(顧覺(jué)奮)，Chen ZJ(陳紫娟).The studies and applications of α-glucosidase inhibitors.Prog Pharm Sci(藥學(xué)進(jìn)展)，2009，33(2):62-67.

6 Du WQ(杜偉奇)，Shi XF(施秀芳)，Qiu MY(邱明艷)，et al.Research progress on treatment of diabetes drugs.Chin J Hosp Pharm(中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2005，25:67-69.

7 Jong-Anurakkun N，Bhandari MR，Hong G，et al.α-Glucosidase inhibitor from Chinese aloes.Fitoterapia，2008，79:456-457.

8 Lam SH，Chen JM，Kang CJ，et al.α-Glucosidase inhibitors from the seeds of Syagrus romanzoffiana.Phytochemistry，2008，69:1173-1178.

9 Lee SS，Lin HC，Chen CK.Acylated flavonol monorhamnosides，α-glucosidase inhibitors，from Machilus philippinensis.Phytochemistry，2008，69:2347-2353.

10 Kang WY(康文藝)，Zhang L(張麗)，Song YL(宋艷麗).α-Glucosidase inhibitors from Rubia cordifolia.Chin J Chni Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2009，34:1104-1107.

11 Kang WY(康文藝)，Wang JM(王金梅)，Zhang L(張麗).α-Glucosidase inhibitors from leaves of Forsythia suspense in Henan province.Chin J Chi Mat Med(中國(guó)中藥雜志)，2010，35:1156-1159.

12 Hu FL，Deng CH，Zhang XM.Development of high performance liquid chromatogratography with immobilized enzyme onto magnetic nanospheres for screening enzyme inhibitor.J Chromatogr B，2008，871:67-71.

13 Zhu WJ(朱文佳).Studies on the inhibitory effects of active component from TCM on α-glucosidase.Dalian Polytechnic University(大連工業(yè)大學(xué))，MD.2010.

14 Gu JP(顧江萍)，Liang XM(梁鑫淼).Study on inhibition of the Chinese herbal medicines on α-glucosidase.J Chin Model TCM(中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志)，2005，1:116-118.

15 Lin YX(林岳賢).Bioactive Components Isolated from the Leaves of Cinnamomum osmophloeum Kanehira.Taiwan:National Chung Hsing University(國(guó)立中興大學(xué))，MD.2008.

16 Kang WY(康文藝)，Zhang L(張麗)，Song YL(宋艷麗).α-Glucosidase inhibitors from Luculia pinciana.Chin J Chi Mat Med(中國(guó)中藥雜志)，2009，34:406-409.

17 Wang JY(王鏡巖)，Zhu SG(朱圣庚)，Xu CF(徐長(zhǎng)發(fā)).Biochemistry(生物化學(xué)).Beijing:Higher Education Press，2002.371.