郭丹釗，陳 鈞，杜向萍，張春曉，潘 靜

1江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院;2江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013

湖北釘螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的唯一中間宿主［1］，因此殺滅釘螺是控制血吸蟲病流行的重要措施［2］。我國(guó)主要采用化學(xué)滅螺方法，如五氯酚鈉、氯硝柳胺等，化學(xué)藥物滅螺效果雖好，但都不同程度地存在選擇性較弱、持久性差、易造成環(huán)境污染等問題［3］。為彌補(bǔ)化學(xué)殺螺劑的不足，研究和開發(fā)更為安全有效的生物殺螺方法和生物殺螺劑對(duì)于控制血吸蟲病的傳播和保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有重要意義［4，5］。

本實(shí)驗(yàn)室自藥用植物商陸的根際分離到一株真菌菌株Aspergillus fumigatus SL-30，其胞外發(fā)酵液具有顯著的殺螺活性，且對(duì)非靶生物毒性小，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值［6］。在前期的工作基礎(chǔ)上，本研究采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)法對(duì)影響菌株SL-30殺螺活性的主要因素進(jìn)行篩選，并采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，研究了可溶性淀粉，蛋白胨和初始pH三個(gè)顯著因子的最佳水平，為菌株SL-30及其發(fā)酵液中殺螺活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:Aspergillus fumigatus SL-30，本實(shí)驗(yàn)室分離自商陸根際。

釘螺(Oncomelania hupensis):采集自鎮(zhèn)江京口區(qū)長(zhǎng)江村江灘，去氯水清洗后適應(yīng)性培養(yǎng)1～2 d，剔除死螺，挑選6-7旋的健康成年釘螺進(jìn)行殺螺活性測(cè)定。

氯硝柳胺(含量98%)，江蘇省血吸蟲病防治研究所惠贈(zèng);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)菌株SL-30生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)要素的基本原則和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合前期試驗(yàn)，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)可溶性淀粉用量(X1)、蛋白胨用量(X2)、磷酸二氫鉀用量(X3)、硫酸鎂用量(X4)、接種量(X5)、裝液量(X6)、初始pH值(X7)、培養(yǎng)溫度(X8)8個(gè)因素作為影響因素進(jìn)行全面考察，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，響應(yīng)值為殺螺率Y(%)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和各因素水平編碼見表1和表2。運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)各因素效應(yīng)進(jìn)行t檢驗(yàn)，選擇置信度95%以上的因素作為重要因素進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Response surface methodology，RSM)

響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法［7］。在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將得到的三個(gè)主要影響因子可溶性淀粉用量(A)、蛋白胨用量(B)和初始pH(C)進(jìn)一步采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，每個(gè)因子取低、中、高三個(gè)水平:初始pH為1、3、5，可溶性淀粉含量為10、15、20 g/L，蛋白胨含量為2.5、3.75、5 g/L，響應(yīng)值為殺螺率Y(%)。數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程，通過對(duì)回歸方程的方差分析，可以評(píng)價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度。并用響應(yīng)面圖和等高圖直觀的描繪結(jié)果，同時(shí)求出響應(yīng)值最大時(shí)各因子的水平。

1.2.3 殺螺率測(cè)定

將發(fā)酵液過濾得發(fā)酵濾液，并稀釋至1.6%，采用WHO推薦的浸殺法測(cè)定濾液的殺螺活性，并統(tǒng)計(jì)各組殺螺率。

1.2.4 模型驗(yàn)證

將優(yōu)化試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，確定其極值點(diǎn)以及取得極值時(shí)相應(yīng)的自變量取值，進(jìn)行六批次驗(yàn)證試驗(yàn)及可靠性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman結(jié)果分析

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果列于表1，經(jīng)Design-Expert 7.0.0分析和整理，各因素的效應(yīng)分析結(jié)果見表2，可溶性淀粉用量(X1)，蛋白胨用量(X2)和初始pH(X7)作為重要因子的可信度大于95%，對(duì)菌株SL-30發(fā)酵濾液的殺螺活性影響顯著，并以此作為主要因素進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and result of Plackett-Burman

表2 各因素影響及重要性評(píng)價(jià)Table 2 Levels and effects of variables

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

對(duì)影響發(fā)酵濾液殺螺活性的三個(gè)關(guān)鍵因素可溶性淀粉，蛋白胨和初始pH值進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，分別以可溶性淀粉15 g/L，蛋白胨3.75 g/L和初始pH 3為中心點(diǎn)實(shí)施響應(yīng)面試驗(yàn)，發(fā)酵濾液殺螺率為響應(yīng)值，結(jié)果列于表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Process variables and levels in response surface Box-Behnken design and reponse value

運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)面二次多元回歸模型:

對(duì)該方程式進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表4?；貧w模型的F值為12.31，其P=0.0065＜0.01，說明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)的P=0.0732＞0.05，表明失擬項(xiàng)對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，回歸模型無失擬因素存在，回歸模型有效［8］。精密度(Adeq precision)是有效信號(hào)與噪音的比值，大于4.0視為合理，本試驗(yàn)精密度達(dá)到10.406，因此精密度較好;方程模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9568，表明該方程模型可解釋95.68%的發(fā)酵濾液殺螺活性變化，因此該模型可用于菌株SL-30發(fā)酵濾液的殺螺活性分析與預(yù)測(cè)。

由表4還可以看到，因素A和B對(duì)發(fā)酵濾液殺螺活性的線性效應(yīng)顯著(其P值均小于0.05)，C不顯著，AB的交互影響顯著，而AC和BC不顯著，二次項(xiàng)效應(yīng)均顯著，表明可溶性淀粉、蛋白胨和初始pH對(duì)發(fā)酵濾液殺螺活性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of quadratic polynomial model

168.04 0.44 0.5363 AB 1 5459.73 35.35 0.0019 AC 1 44.42 0.29 0.6147 BC 1 15.13 0.098 0.7669 A2 1 1449.67 9.39 0.0280 B2 1 2867.35 18.56 0.0077 C2 1 893.52 43.37 0.0012殘差項(xiàng) 5 154.45失擬項(xiàng) 3 255.49 8.91 0.0732純誤差 2 2.89 R2=0.9568 Adj R2=0.8791 C 1 Adeq Precision=10.406

2.2.2 響應(yīng)面分析

三維響應(yīng)面圖是回歸方程的圖形表表述，反應(yīng)出各因素的交互作用，每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)變量保持在零水平［9］，通過響應(yīng)面圖可以直觀、高效地找到最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用及最大相應(yīng)值;等高線圖的形狀表示交互作用的強(qiáng)弱，形狀為圓形交互作用弱，橢圓形則表示交互作用強(qiáng)［10］。在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用軟件作可溶性淀粉、蛋白胨和初始pH對(duì)發(fā)酵濾液殺螺活性影響的響應(yīng)面和等高線圖(圖1、2和3)。由此，可對(duì)任何兩個(gè)因素的交互作用進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)［11］。

圖1 可溶性淀粉與蛋白胨用量對(duì)殺螺活性交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot for the cross action of soluble starch content and peptone content on molluscicidal activity

圖1顯示，當(dāng)初始pH為3時(shí)，可溶性淀粉與蛋白胨含量對(duì)發(fā)酵濾液殺螺率的交互影響。由圖可以看出，當(dāng)可溶性淀粉的用量固定，蛋白胨的用量必須在一定的范圍內(nèi)才可使發(fā)酵濾液的殺螺活性達(dá)到最大，也就是說，碳氮比要有一個(gè)合適的范圍，若超出該范圍則會(huì)降低發(fā)酵濾液的殺螺活性，說明過高或過低的碳氮比不利于菌絲的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而影響殺螺活性成分在發(fā)酵液中的合成和積累。

圖2 可溶性淀粉用量與初始pH對(duì)殺螺活性交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot for the cross action of soluble starch content and initial pH on molluscicidal activity

蛋白胨用量為3.75 g/L條件下，初始pH和可溶性淀粉用量對(duì)發(fā)酵濾液殺螺活性的影響如圖2所示。由圖可以看到，當(dāng)可溶性淀粉用量為12.5 g/L左右時(shí)，隨著初始pH的逐漸增大，發(fā)酵濾液的殺螺率呈現(xiàn)先升高后降低的過程，當(dāng)初始pH調(diào)整為2左右時(shí)，隨著可溶性淀粉用量的增加也呈現(xiàn)相同的變化，這表明初始pH和可溶性淀粉用量過高或過低都不利于菌絲的生長(zhǎng)和殺螺活性成分的合成?？扇苄缘矸墼?2.5～20 g/L范圍內(nèi)，初始pH控制在2～4，發(fā)酵濾液可呈現(xiàn)最大的殺螺活性。

圖3顯示當(dāng)可溶性淀粉用量為15 g/L時(shí)，蛋白胨含量與初始pH對(duì)發(fā)酵濾液殺螺率的交互影響。由圖可以看到，當(dāng)?shù)鞍纂擞昧看蠹s為2.66 g/L左右時(shí)，隨著初始pH的逐漸增大，發(fā)酵濾液的殺螺率先升高后降低，當(dāng)初始pH調(diào)整為2左右時(shí)，隨著蛋白胨用量的增加也呈現(xiàn)相同的變化，這表明初始pH和蛋白胨用量過高或過低都不利于菌絲的生長(zhǎng)和殺螺活性成分的合成?？扇苄缘矸墼?.66～4.38 g/L范圍內(nèi)，初始pH控制在2～4，發(fā)酵濾液的殺螺活性最強(qiáng)。

圖3 蛋白胨用量與初始pH對(duì)殺螺活性交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot for the cross action of peptone content and initial pH on molluscicidal activity

以發(fā)酵濾液殺螺活性最高為優(yōu)化目標(biāo)，以可溶性淀粉用量、蛋白胨用量和初始pH為優(yōu)化對(duì)象，利用Design-Expert7.0.0軟件對(duì)上述模型進(jìn)行了優(yōu)化處理，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為可溶性淀粉16.40 g/L，蛋白胨3.76 g/L，初始pH 3(為方便操作，將軟件計(jì)算得到的pH 3.05在操作中改為pH 3)，該模型理論預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值為98.949%。

2.3 模型驗(yàn)證

結(jié)合以上的優(yōu)化條件，其他影響不顯著的因子取中間值，得到菌株SL-30的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:可溶性淀粉16.40 g/L，蛋白胨3.76 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，接種量0.5%，裝液量50 ml/250 ml，初始pH 3，培養(yǎng)溫度28℃。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可靠性，利用以上優(yōu)化培養(yǎng)條件分6批次進(jìn)行發(fā)酵，每批三個(gè)重復(fù)，測(cè)定發(fā)酵濾液的殺螺活性均在98%左右(表5)，接近預(yù)測(cè)值，6批次之間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%，二者的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。因此，基于響應(yīng)面法所得的菌株SL-30發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討論

植物根際有益微生物是土壤微生物的一部分，它們可在根際定殖并代謝產(chǎn)生種類豐富的次級(jí)代謝物［12］，其中存在具有抑菌殺蟲等生物活性的成分［13-15］，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。從生態(tài)學(xué)角度來看，設(shè)法將可產(chǎn)生殺螺活性物質(zhì)的微生物定殖于植物根際環(huán)境，構(gòu)建微生物-植物生態(tài)滅螺抑螺系統(tǒng)，可長(zhǎng)效控制釘螺的繁殖和危害，在一定程度上緩解化學(xué)滅螺藥物帶來的弊端。

分離自商陸根際的真菌菌株SL-30，其發(fā)酵液具有顯著的殺螺活性，對(duì)光照穩(wěn)定，且對(duì)非靶生物毒性低，具有較好的開發(fā)前景。其發(fā)酵液中的殺螺活性物質(zhì)有待進(jìn)一步分離和鑒定，以及菌株在植物根際的定殖也有待進(jìn)一步研究和探索。

表5 優(yōu)化發(fā)酵條件的驗(yàn)證Table 5 Verification of optimum fermentation conditions

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