林毅剛， 夏 鋼

（華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海市腦功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062）

α-N-乙酰半乳糖胺酶的表達(dá)及活性檢測

林毅剛， 夏 鋼

（華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海市腦功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062）

為了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的篩選、檢測方法，實(shí)驗(yàn)中提取腦膜金黃桿菌的基因組DNA，以此為模板PCR擴(kuò)增出α-N-乙酰半乳糖胺酶（A4）.將A4克隆至pET-24a載體，轉(zhuǎn)化Bl21表達(dá)菌株進(jìn)行蛋白表達(dá).使用親和層析方法純化His-A4酶，選擇顯色底物驗(yàn)證酶活性.同時(shí)，改進(jìn)了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細(xì)胞膜包被于ELISA檢測平板中，以紅細(xì)胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA方法檢測酶活性.此研究建立了新型ELISA實(shí)驗(yàn)方法，以此方法驗(yàn)證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時(shí)間依賴性.

α-N-乙酰半乳糖胺酶； 重組蛋白； 蛋白純化； ELISA方法

ELISA method

0 引 言

1900年Landsteiner發(fā)表論文［1］，闡述了人類紅細(xì)胞表面ABO血型抗原并根據(jù)紅細(xì)胞表面抗原的差異，將人血?jiǎng)澐譃锳、B、AB和O4種血型.1980年 Watkins等3位科學(xué)家分別闡述了紅細(xì)胞表面ABO抗原的碳水化合物結(jié)構(gòu)［2］.暴露于紅細(xì)胞表面的寡糖鏈上糖基的種類和順序決定了紅細(xì)胞表面的抗原.紅細(xì)胞先在表面合成抗原H，若將乙酰半乳糖胺基連接在抗原H肽鏈中的半乳糖上，這就形成了抗原A，相應(yīng)的紅細(xì)胞稱為A型紅細(xì)胞；同理，若半乳糖被連接至同樣位置，成為抗原B，這樣就形成了B型紅細(xì)胞；若紅細(xì)胞的表面既有抗原A又有抗原B，則形成AB型紅細(xì)胞.

在輸血治療中，由于紅細(xì)胞表面抗原與血清中抗體的存在，因此如果接收到相同血型血液的輸血，不會(huì)發(fā)生意外.但如果錯(cuò)誤輸血，抗原抗體發(fā)生凝集，可造成紅細(xì)胞裂解，產(chǎn)生急性血管內(nèi)溶血性輸血反應(yīng)，從而可能致人死亡［3］.而O型紅血液中紅細(xì)胞不含A、B抗原，所以可以安全地輸給A、B、AB與O型的受血者，因此O型血往往被稱為“通用血”（universal red blood cells，RBCs）［4］.通用型血可以極大減少因ABO血型不合所致輸血反應(yīng)，明顯提高輸血安全性，因此將其它血型轉(zhuǎn)換成O型通用血具有重要意義.

使用酶切方法將紅細(xì)胞表面最外端的糖苷切除，從而消除抗原抗體反應(yīng)是一種常用的制備通用紅細(xì)胞的方法.研究證明［5］α-半乳糖苷酶作用于兩個(gè)半乳糖之間的糖苷鍵，將B抗原最外端的半乳糖切除；α-N-乙酰半乳糖胺酶則作用于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺之間的糖苷鍵，將A抗原最外端的N-乙酰半乳糖胺切除.這兩種酶可以分別作為B→O和A→O血型轉(zhuǎn)變的工具酶.

Goldstein等人在1982年最早提出酶解法制備通用型RBC［6］，并從咖啡豆克隆了α-半乳糖苷酶基因，在臨床二期檢驗(yàn)成功，實(shí)現(xiàn)B→O血型改造［7］.相比之下，A→O血型改造進(jìn)展緩慢，Goldstein認(rèn)為原因是［8］自然界的α-N-乙酰半乳糖胺酶的數(shù)量比α-半乳糖胺酶少.

目前，科學(xué)家已從植物、海洋生物和動(dòng)物臟器中發(fā)現(xiàn)了可以用以切除紅細(xì)胞表面抗原最外端糖苷的多種糖苷酶，它們的酶切效率、作用溫度和作用pH各不相同.Liu［4］等人在最近的研究中，報(bào)導(dǎo)了他們從2 500多種細(xì)菌與真菌中篩選出一種糖苷酶，具有α-N-乙酰半乳糖胺酶的活性，可以比較高效地切除A型紅細(xì)胞表面的N-乙酰半乳糖胺.此酶反應(yīng)條件溫和，活性是已報(bào)道的α-N-乙酰半乳糖胺酶中最好的.在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中基因登錄號為AM039444［4］（為方便表示，此基因在本文內(nèi)代稱為A4）.經(jīng)過晶體結(jié)構(gòu)的測定，此酶的空間結(jié)構(gòu)已非常清楚，因此選取此酶用于實(shí)驗(yàn).此基因全長為1 335 bp，編碼的蛋白分子量約為50.5 kD，試驗(yàn)酶解A型表面抗原.

本文從細(xì)菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增出目的基因，在表達(dá)菌株中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，用ELISA方法檢測，α-N-乙酰半乳糖胺酶確實(shí)可以除去A型紅細(xì)胞表面最外側(cè)的糖苷，為進(jìn)一步大量制備α-N-乙酰半乳糖胺酶用于制備通用型血奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

克隆載體pET24a購自美國Novagen公司，大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司.

A4基因所在的細(xì)菌名為Chryseobacterium meningosepticum，ATCC登錄號為33958，購自美國ATCC菌株庫.

1.1.2 主要試劑

HindIII與SacI購自美國NEB公司，Taq酶、dNTP、DL2000 Marker和1 kbp Marker等常用試劑購于Takara大連有限公司.其它所有用到的化學(xué)試劑均為市售分析純.對硝基苯酚-N-乙酰-α-半乳糖胺（PNP-A）購自美國Sigma公司.抗A血型定型試劑購自上海血液所.二抗羊抗鼠與TMB顯色液，5×SDS蛋白上樣緩沖液和BCA試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白Marker PageRuler Prestained Protein Ladder購自美國Fermentas公司.鎳柱（Ni2＋agarose）購自美國Bio-Rad公司.質(zhì)粒小提試劑盒，膠回收試劑盒，PCR回收試劑盒均購自上海捷瑞生物有限公司.PCR引物由Invitrogen上海分公司合成.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增序列與原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI報(bào)道的序列編號AM039444（A4），設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列，具體序列為

PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 min，72℃延伸1 min30 s，36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

DNA回收試劑盒回收A4基因片段與克隆載體pET24a，均經(jīng)過SacI和HindIII雙酶切，將目的片段與載體片段用DNA回收試劑盒回收，將目的片段與載體連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pET24a-A4，構(gòu)建的pET24a-A4用SacI與HindIII雙酶切鑒定，并經(jīng)過測序驗(yàn)證序列的正確性.

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)

將正確的重組質(zhì)粒pET24a-A4，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，挑取單克隆到5 mL含50μg／mL卡那霉素（Kana）的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜搖菌.次日以1∶100接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（50μg／mL Kana），于37℃搖床振蕩培養(yǎng)，至吸光度（OD 值）達(dá)0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol／L.20℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4 h后取1 mL培養(yǎng)物于8 000 r／min下離心5 min，菌液重懸于PBS緩沖液中，用超聲破碎儀以20 kHz的頻率超聲破碎菌液，12 000 r／min離心5 min，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，收集含重組表達(dá)的蛋白備用.取10μL上述處理好的重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離鑒定，考馬斯亮藍(lán)染色.

1.2.3 重組蛋白的純化

挑取單克隆到20 mL含50μg／mL Kana的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng).次日以1∶100接種于1 L LB液體培養(yǎng)基中（50μg／mL Kana），過夜誘導(dǎo)表達(dá)蛋白（具體步驟同重組蛋白的誘導(dǎo)）.8 000 r／min離心5 min，收集全部菌液，PBS漂洗兩遍后，加入30 mL PBS超聲破碎細(xì)菌，12 000 r／min 4℃離心20 min，取上清，參照Bio-Rad實(shí)驗(yàn)操作手冊，上清與Ni＋親和層析柱結(jié)合，用全自動(dòng)快速蛋白液相層析系統(tǒng)儀器純化蛋白.

具體步驟 5 mmol／L咪唑緩沖液10 mL平衡整個(gè)系統(tǒng)（1 mL體積鎳柱）；上樣30 mL上清溶液；10 mmol／L咪唑緩沖液10 mL洗去非特異結(jié)合蛋白；咪唑緩沖液濃度逐步提高，從10 mmol／L至250 mmol／L洗脫目的蛋白；最后用1 mol／L咪唑緩沖液10 mL洗脫全部蛋白.收集所有流出液以備SDS-PAGE檢測.

1.2.4 酶活性測定

α-N-乙酰半乳糖胺酶對底物對硝基苯酚-N-乙酰-α-半乳糖胺（PNP-A）有專一性，能夠特異性酶解該底物，水解后的顯色基團(tuán)對硝基苯酚將顯出黃顏色，通過此方法證實(shí)酶有活性.以顯色反應(yīng)的進(jìn)行程度作為酶活性的判斷標(biāo)志.在酶反應(yīng)過程中通過連續(xù)觀測吸收值ΔOD400／t，對酶解效率進(jìn)行測定，計(jì)算其Kcatobserve，以評價(jià)酶活性.

測定PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為PNP-A的濃度（μmol／L），縱坐標(biāo)為OD值，通過此曲線，可從OD值的讀數(shù)計(jì)算出酶作用于底物后反應(yīng)生成的產(chǎn)物濃度.

取200μL A4酶溶液（200μmol／L，酶濃度過量），加入等體積PNP-A溶液，使底物終濃度分別為2.5、5、10和20μmol／L.充分反應(yīng)后，讀取在400 nm的光吸收值.根據(jù)數(shù)值，以濃度對OD值作圖，得到PNP-A標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)（ε）（濃度為1 mol／L時(shí)的吸光系數(shù)）.

Kcatobserve測定 200μL0.2μmol／L的A4酶溶液，加入PNP-A，終濃度為50μmol／L，立即開始?xì)?0 s讀取一次OD400，得到產(chǎn)物生成曲線，計(jì)算反應(yīng)初期線性階段的斜率K（OD／t），按照如下公式計(jì)算Kcatobserve＝K×ε／（A4酶摩爾濃度）.

1.2.5 ELISA鑒定

取5 mL A型紅細(xì)胞，用75 mmol／L的氯化鉀低滲液溶脹處理，3次低滲溶液洗滌離心，再經(jīng)3次生理鹽水洗滌離心后，得到較純凈的細(xì)胞膜懸濁液.將破碎的紅細(xì)胞膜懸濁液用PBS稀釋至相當(dāng)于107個(gè)紅細(xì)胞／mL，加入96孔ELISA酶標(biāo)板100μL／孔，室溫包被2 h，用PBS洗板5次；加入用PBS稀釋的1%BSA100μL／孔，室溫封閉1 h，PBS洗板5次；加入100μL純化的A4酶，毎孔100μL，終濃度分別為3.3、10、33和100μg／mL，37℃放置過夜，PBS洗板5次；將1%BSA稀釋10倍的抗A血型定型試劑加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBS洗板5次；二抗羊抗鼠IgG用1%BSA稀釋3 000倍加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBS洗板5次；充分清洗二抗殘余，毎孔加入TMB顯色液50μL／孔，室溫避光孵育5 min；毎孔加入2 mol／L H2SO4，50μL／孔，終止顯色反應(yīng)；讀取450 nm的光吸收值.

2 結(jié) 果

2.1 pET24a-A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以細(xì)菌基因組DNA為模板，利用A4基因上游引物A4-F和下游引物A4-R進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在1 000 bp上方可見約1 350 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1a）；擴(kuò)增的基因片段經(jīng)測序鑒定后，閱讀框完整，與報(bào)道的A4基因一致，說明擴(kuò)增出A4基因.將構(gòu)建了的重組質(zhì)粒pET24a-A4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后，挑取單克隆提質(zhì)粒后，經(jīng)SacI和HindIII雙酶切驗(yàn)證，在瓊脂糖凝膠電泳圖中可見一條約1 350 bp的目的基因條帶與一條約5 000 bp的載體條帶（見圖1b），與預(yù)期一致，經(jīng)測序后證明A4基因插入在SacI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，pET24a-A4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 pET24a-A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建（單位：bp）Fig.1 Construction of pET24a-A4 plasmid（Unit：bp）

2.2 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將質(zhì)粒pET24a-A4轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，離心后分別收集上清與沉淀，10%的SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色及脫色后，與未誘導(dǎo)的pET24a-A4相比，在55 kD的下方處可見一條明顯的增粗的新生蛋白條帶（見圖2），與預(yù)期分子量52 kD相符.目的蛋白主要存在于上清中，部分在沉淀中.

圖2 A4蛋白誘導(dǎo)表達(dá)（單位：kD）Fig.2 Expression of His-A4（Unit：kD）

2.3 A4蛋白的純化分析

pET24a-A4質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后，目的蛋白與帶His-tag標(biāo)簽可形成融合蛋白，His-tag可與鎳柱結(jié)合，通過親和層析方法純化蛋白.對成功誘導(dǎo)的菌株進(jìn)行大量培養(yǎng)誘導(dǎo)后，將菌體超聲破碎后，蛋白溶于上清PBS中，取上清過鎳柱純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離與考馬斯亮藍(lán)染色分析.純化后的A4蛋白為單一的蛋白條帶（見圖3），雜帶較少，且與誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大小一致，說明純化效果很好.經(jīng)BCA方法測定，蛋白濃度為4.2 mg／mL.

圖3 A4蛋白純化（單位：kD）Fig.3 Purification of His-A4 protein（Unit：kD）

2.4 重組蛋白對底物PNP-A的活性測定

將純化后的蛋白樣品進(jìn)行活性檢測.實(shí)驗(yàn)中，為了測定PNP-A濃度與對應(yīng)OD400值的關(guān)系，先用40μmol／L的初始濃度，按2倍做倍比稀釋，做20、10、5和2.5μmol／L4個(gè)濃度梯度，繪制PNP-A的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

被檢His-A4蛋白濃度稀釋至0.2μmol／L進(jìn)行測定（見圖4），測得10 s的反應(yīng)速率為酶反應(yīng)的初速度，即Δt為10 s，斜率為0.005ΔOD／t，根據(jù)PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出產(chǎn)物生成速率為0.242 1μmol·L－1·s－1，計(jì)算酶動(dòng)力得Kcatobserve＝Δ［PNP－A］／（Δt×A4酶摩爾濃度）＝1.159 s－1.

2.5 ELISA方法檢測用酶處理過的紅細(xì)胞與抗A定型試劑反應(yīng)

紅細(xì)胞破碎后離心得到的紅細(xì)胞膜，預(yù)先包埋在酶標(biāo)板底部，摸索建立新穎的ELISA方法對純化過后的酶進(jìn)行活性檢測，用酶處理A型血液的紅細(xì)胞，α-N-乙酰半乳糖胺酶能酶解A型紅細(xì)胞表面的抗原.實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)A型紅細(xì)胞膜沒有用酶處理時(shí)，與抗A定型試劑反應(yīng)效果較強(qiáng)，OD值較高，而酶解過后A型細(xì)胞表面抗原就會(huì)減少，與抗A定型試劑反應(yīng)就會(huì)變?nèi)?不同酶濃度對紅細(xì)胞的影響不同，隨著酶濃度的增高3.3、10、33和100μg／mL，OD450值就越低（見圖5），說明酶能切除細(xì)胞表面的抗原，抗原抗體反應(yīng)降低.同樣隨著酶作用的時(shí)間延長，抗原抗體反應(yīng)就越弱（見圖6），說明酶確實(shí)能夠切除A型紅細(xì)胞最外的糖苷，與抗A定型試劑反應(yīng)降低.

圖4 酶反應(yīng)的初速度計(jì)算Fig.4 Calculation of the initial velocity of enzyme reaction

圖5 不同酶濃度下的ELISA檢測效果Fig.5 Detection effects of ELISA at different concentrations of enzyme

圖6 不同時(shí)間下的ELISA檢測效果Fig.6 Detection effects of ELISA at different times of enzyme

3 討 論

血液短缺是世界性難題，各國科學(xué)家都在努力攻克.如果能將其它血型的血液轉(zhuǎn)換為O型血，并且輸血安全有效，那么這通用型血液具有巨大的經(jīng)濟(jì)與臨床價(jià)值［9，10］，同時(shí)對鐮刀貧血癥、地中海貧血癥和白血病等需要反復(fù)輸血以維持生命的病人使用通用型血，也是理想的輸血治療方案［6，11，12］.

本實(shí)驗(yàn)克隆了以往報(bào)道的活性最好的α-N-乙酰半乳糖胺酶基因，并在細(xì)菌中進(jìn)行過表達(dá)所編碼的蛋白，在IPTG終濃度為1 mmol／L，37℃過夜誘導(dǎo)的條件下，SDS-PAGE分析后得到52 kD的蛋白，絕大部分蛋白形成包涵體在沉淀中.因此重新優(yōu)化了誘導(dǎo)條件，在IPTG終濃度為0.4 mmol／L，低溫20℃過夜誘導(dǎo)的條件下，經(jīng)SDS-PAGE分析后，可知重組A4酶經(jīng)低溫誘導(dǎo)可表達(dá)，產(chǎn)生活性蛋白，易于純化，為大規(guī)模純化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

為了證明α-N-乙酰半乳糖胺酶可消除A型紅細(xì)胞表面的抗原，本文改進(jìn)了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細(xì)胞膜包被于ELISA檢測平板中，以紅細(xì)胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA方法對改造過后的A型紅細(xì)胞進(jìn)行抗體凝集檢測.本實(shí)驗(yàn)中建立的新型ELISA方法驗(yàn)證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時(shí)間依賴性.此優(yōu)化的ELISA方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于更加接近實(shí)際情況，酶直接作用于紅細(xì)胞膜，不但可以檢測酶活性，更可以體外模擬A型血轉(zhuǎn)化為O型血，為以后相關(guān)檢測提供了檢測方法.

我國科學(xué)家已經(jīng)使用α-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)B型血向O型血的轉(zhuǎn)化［13］，但是A型血的轉(zhuǎn)化仍然不順利，主要難題是酶活性較低.目前科研人員在自然界中繼續(xù)尋找α-N-乙酰半乳糖胺酶，期望得到活性更高的酶.另一方面，針對已經(jīng)報(bào)道的酶，運(yùn)用基因重組等分子生物學(xué)手段過量表達(dá)蛋白的工作也在積極進(jìn)行.但是現(xiàn)有的α-N-乙酰半乳糖胺酶催化效率仍然比較低，無法用于實(shí)際生產(chǎn).由此可見，利用糖苷酶酶解紅細(xì)胞表面抗原上的糖分子，從而得到通用紅細(xì)胞是一項(xiàng)具有巨大潛力的技術(shù)方案，前人已經(jīng)在這方面做出了不懈的努力，但是至今人們沒有得到理想的工具酶.本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的A4基因，已成功改變了A型紅細(xì)胞表面抗原的結(jié)構(gòu)，下一步擬進(jìn)行通過體外進(jìn)化技術(shù)——DNA改組（DNA shuffling）［14］，提高酶活性.期望得到活性高的酶，為大規(guī)模血型轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ).

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Overexpression and characterization of a bacterial α-N-acetylgalactosaminidase

LIN Yi-gang， XIA Gang

（Key Laboratory of Brain Functional Genomics，Ministry of Education，Shanghai Key Laboratory of Brain Functional Genomics，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

The coding sequence of alpha-N-acetylgalactosaminidase（A4）was amplified from genomic DNA of Chryseobacterium meningosepticumand subcloned into pET24a，which was then transformed into BL21（DE3）for overexpression of His-A4.The overexpressed His-A4 enzyme was purified by using affinity chromatography and its activity was comparable to that previously reported by using a conventional method with an artificial substrate.To better measure the activity ofα-N-acetylgalactosaminidase in real application，we established a novel method in which we directly used the surface antigen of red blood cell as substrate and applied ELISA to the detection of un-cleaved antigen.The activity of His-A4 was evaluated in the new ELISA method and was demonstrated to be able to decrease the blood cell surface antigen-antibody reaction in concentration-and time-dependent manner.

α-N-acetylgalactosaminidase； recombination protein； protein purification；

Q55

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2012.04.009

1000-5641（2012）04-0067-08

2011-05

教育部重點(diǎn)項(xiàng)目（V200704）

林毅剛，男，碩士研究生.

夏鋼，男，研究員.E-mail：gxia＠brain.ecnu.edu.cn.