代 卉， 侯連生

（華東師范大學 生命科學學院，上海 200062）

盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中尿囊酸酶表達的定量定位研究

代 卉， 侯連生

（華東師范大學 生命科學學院，上海 200062）

用免疫熒光技術對KAx-3多細胞發(fā)育不同階段的尿囊酸酶進行定位觀察，用Western blot分析野生型細胞KAx-3和突變型細胞AK127多細胞發(fā)育中尿囊酸酶的表達情況.結果顯示：在細胞聚集階段，尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌細胞膜附近存在較多；在細胞丘階段，尿囊酸酶在細胞丘外層細胞中熒光強度較強；在蛞蝓體階段，尿囊酸酶在前柄細胞中的表達量明顯多于前孢子細胞；在子實體成熟的過程中，在前柄細胞區(qū)與前孢子細胞區(qū)交界處熒光強度最強，該區(qū)域內細胞將分化成前柄細胞B.據(jù)此推測尿囊酸酶的定位表達可能與盤基網(wǎng)柄菌細胞分化的類型相關.Western blot結果顯示：在KAx-3發(fā)育過程中尿囊酸酶的表達量呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，發(fā)育至18 h左右達到最大值；而AK127中尿囊酸酶的表達量始終在低水平徘徊.這表明gp150的缺失影響了尿囊酸酶的表達.實驗結果提示，尿囊酸酶的表達量與發(fā)育時間有關，并且這種表達量的變化與gp150存在著密切的關系.

尿囊酸酶； 定量分析； 定位觀察； gp150

0 引 言

野生型盤基網(wǎng)柄菌多細胞發(fā)育的不同階段形態(tài)各不相同，因此，將其大致地分為了4個發(fā)育階段：細胞聚集階段、細胞丘階段、蛞蝓體階段和由孢子細胞與柄細胞構成的子實體階段［1］.盤基網(wǎng)柄菌的多細胞發(fā)育始于生存環(huán)境中食物的缺乏.饑餓的盤基網(wǎng)柄菌細胞會分泌cAMP誘導臨近細胞向其聚集形成細胞丘，然后在細胞分化因子的作用下開始初步分化，形成前柄細胞（prestalk cell，pst）和前孢子細胞（prespore cell，psp）.前柄細胞分化比較復雜，又進一步分化成各種亞型：位于細胞丘頂端是前柄細胞A（prestalk A cell，pstA），表達前柄細胞特異基因ecmA；而前柄細胞B（prestalk B cell，pstB）則位于細胞丘底部，表達ecmB特異基因.蛞蝓體階段，細胞分化進一步明顯：前端形成由前柄細胞A和前柄細胞O（prestalk O cell，pstO）組成的前柄細胞區(qū)；后端則大部分為psp細胞；底部仍有少量pstB細胞存在，被稱之為后衛(wèi)細胞；此外，在pstO細胞與psp細胞的交界處也存在pstB細胞.進入拔頂階段后，可以在前柄細胞區(qū)檢測到新形成的前柄細胞AB（prestalk AB cell，pstAB），它同時表達ecmA和ecmB基因.在盤基網(wǎng)柄菌的整個發(fā)育過程中，pstO細胞可分化成pstA細胞，pstA細胞可分化成pstB細胞，并最終形成柄細胞；而psp細胞最終形成成熟的孢子［1，2］.因此與前柄細胞分化相關的因子引起了我們的研究興趣.有研究報道氨可以抑制盤基網(wǎng)柄菌在多細胞發(fā)育過程中細胞對cAMP的趨化作用［3］；氨通過抑制細胞分化因子的累積可抑制柄細胞的發(fā)育，并促進孢子細胞的成熟；氨刺激前孢子細胞基因表達的同時抑制前柄細胞基因的表達［4，5］；嘌呤代謝途徑中產(chǎn)生的氨在機體缺乏氮源時可作為氮的來源［6］.本實驗室篩選到的相關基因尿囊酸酶（allanoicase，EC3.5.3.4）是生物體嘌呤代謝途徑中一種重要的酶，可水解尿囊酸為尿素和乙醛酸，在低等生物中還可進一步分解成為氨和二氧化碳［7］，可見尿囊酸酶與氨的代謝有著密切關系.但是盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育過程中尿囊酸酶的分布位置和表達情況未見報導，故本文對此進行了研究，為深入探討尿囊酸酶對細胞發(fā)育過程的影響提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細胞株與細胞培養(yǎng)

盤基網(wǎng)柄菌KAx-3與AK127均為加拿大多倫多大學Dr.Siu實驗室提供，按Sussman法［8］將盤基網(wǎng)柄菌KAx-3和AK127培養(yǎng)于SM培養(yǎng)基上并喂食以克雷伯氏菌，收集生長對數(shù)期的細胞，并用磷酸緩沖液（pH6.4）將待發(fā)育的細胞洗凈.

1.2 細胞發(fā)育

1.2.1 蓋玻片上的細胞發(fā)育

用PDF緩沖液（MgCl20.5 g，硫酸鏈霉素0.5 g，KCl 1.5 g，K2HPO41.6 g，KH2PO41.6 g，加水至1 L，pH6.4）配制成2×106個／mL的細胞懸浮液，在預先涂有0.1%（w／v）多聚賴氨酸的蓋玻片上加500μL細胞懸浮液，靜置15 min，吸去400μL上清液.將蓋玻片放在濕盒中，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中開始發(fā)育.

1.2.2 瓊脂板上的細胞發(fā)育

用PDF緩沖液配制成2×108個／mL的細胞懸浮液，鋪500μL懸浮液在2%的瓊脂板上，放入24℃恒溫箱中進行發(fā)育.每隔2 h收集發(fā)育細胞.細胞計數(shù)，按1×107個／管分裝于各eppendorf管中.

1.3 免疫熒光

將發(fā)育至不同階段的KAx-3細胞放入4℃冰箱預冷1 min，室溫下用3.7%甲醛溶液（pH6.4）固定細胞15 min，再用－20℃預冷的含1%甲醛的甲醇溶液固定5 min，1%BSA封阻20 min，然后用抗尿囊酸酶蛋白的抗體孵育1 h（1∶500），0.05%PBST緩沖液洗3次后，用FITC標記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h（1∶100），再用0.02%PBST緩沖液洗3次，最后用封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察.

1.4 蛋白免疫印跡

每隔2 h收集KAx-3發(fā)育至不同階段的細胞，按Laemmli（1970）法進行SDS-PAGE電泳［9］.每管加入100μL上樣緩沖液，沸水煮5 min，電泳后進行 Western blot轉膜1.5 h，用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維薄膜，在1∶2 000比例稀釋的抗尿囊酸酶蛋白的抗體溶液和按1∶1 000比例稀釋的鼠源GAPDH溶液中孵育2 h，用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG檢測已連接的抗體，并用堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG檢測內參GAPDH.最后用NBT／BCIP顯色，拍照，結果用Quantity One（Bio-Rad公司）軟件分析.

每隔2 h收集AK127發(fā)育至不同階段的細胞，按上述步驟進行蛋白免疫印跡實驗.

2 結 果

2.1 尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌KAx-3中的定位觀察

在細胞發(fā)育初期，主要發(fā)生細胞間相互接觸，然后粘連在一起的事件.這些細胞經(jīng)免疫染色后，在細胞與細胞接觸區(qū)域能見到明顯的尿囊酸酶強熒光，而在細胞內部，熒光強度則比較均勻，表明此時尿囊酸酶主要集中在細胞膜附近區(qū)域（見圖1A箭頭所示）.發(fā)育至細胞丘階段，此時細胞分化尚不明顯，但細胞丘的最外層細胞中尿囊酸酶熒光最強，表明尿囊酸酶在最外層細胞中表達量最多（見圖1B和1C箭頭所示）.在蛞蝓體階段，細胞出現(xiàn)明顯分化.蛞蝓體主要分化成兩個區(qū)域，前端為前柄細胞區(qū)，后部為前孢子細胞區(qū).本文觀察到蛞蝓體前端的熒光明顯強于蛞蝓體后部，這意味著前柄細胞中尿囊酸酶的表達多于前孢子細胞（見圖1D箭頭所示）.在蛞蝓體發(fā)育至成熟子實體的過程中，從總體上看來，前柄細胞區(qū)內尿囊酸酶的表達量高于前孢子細胞區(qū)內尿囊酸酶的表達量.但是由于前柄細胞發(fā)生了亞型分化，尿囊酸酶熒光強弱也發(fā)生了變化.起初整個前柄細胞區(qū)熒光強度基本一致（見圖1E箭頭所示），但是隨著發(fā)育的進行，熒光強度開始發(fā)生變化，在前柄細胞區(qū)與前孢子細胞區(qū)交界處，熒光開始變強（見圖1F中箭頭所示）.隨著發(fā)育時間的增加，前柄細胞和前孢子細胞趨于成熟，兩者交界處的熒光染色愈發(fā)顯得強烈（見圖1G箭頭所示）.

圖1 KAx-3多細胞發(fā)育不同階段中尿囊酸酶的熒光定位Fig.1 Localization of allanoicase in the different development stages of KAx-3

2.2 尿囊酸酶的定量表達

為了進一步探究尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中的作用，用蛋白免疫印跡法研究了盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育各時間段尿囊酸酶的表達情況.

在盤基網(wǎng)柄菌KAx-3細胞整個發(fā)育階段，尿囊酸酶都有表達（見圖2），并且隨著發(fā)育進程，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在18 h達到最多，18 h之后，其表達量驟然下降（見圖4）.AK127細胞是gp150蛋白的基因被剔除的盤基網(wǎng)柄菌突變細胞.在AK127整個多細胞發(fā)育期間，依然觀察到尿囊酸酶能夠表達（見圖3），但是除了發(fā)育8 h時尿囊酸酶的表達量有所增加外，其余時間段尿囊酸酶的表達量便不再呈現(xiàn)上升趨勢，而是在一個相對較低的范圍內波動（見圖4）.

3 分析討論

3.1 關于尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌多細胞發(fā)育過程中的定位分析

圖2 盤基網(wǎng)柄菌KAx-3細胞發(fā)育不同時期尿囊酸酶免疫印跡Fig.2 Western blot analysis of allanoicase during different developmental stages of KAx-3

圖3 盤基網(wǎng)柄菌AK127細胞發(fā)育不同時期尿囊酸酶免疫印跡Fig.3 Western blot analysis of allanoicase during different developmental stages of AK127

圖4 KAx-3和AK127發(fā)育不同階段尿囊酸酶的表達變化Fig.4 Allanoicase quantitative changes of different developmental stages of KAx-3 and AK127

通過觀察發(fā)現(xiàn)，尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌多細胞發(fā)育中的定位具有時空性.聚集初期，細胞尚未進行分化，尿囊酸酶在兩細胞接觸區(qū)域較多，說明其可能參與了細胞最初聚集過程的調控.細胞丘階段，尿囊酸酶則在細胞丘的外層細胞中大量表達，而這些外層細胞有著分化發(fā)育為柄細胞的潛質.隨著發(fā)育的進行，細胞開始了初步分化，特別是蛞蝓體階段，在形態(tài)上能清楚地觀察到蛞蝓體分成前后兩個部分，前1／5為前柄細胞區(qū)，后4／5為前孢子細胞區(qū)，從實驗結果可以看到，尿囊酸酶在蛞蝓體前1／5處的熒光強于后4／5，表明尿囊酸酶在蛞蝓體前柄細胞中的表達量要多于前孢子細胞.在形成成熟子實體的過程中，總體上尿囊酸酶前柄細胞中的表達量多于前孢子細胞，但是隨著細胞進一步分化，在前柄細胞的某一區(qū)域內熒光逐漸增強，說明這個區(qū)域內尿囊酸酶的表達量越來越高.國外學者研究認為，在前柄細胞區(qū)與前孢子細胞區(qū)交界處的細胞將會分化成pstB細胞［1，2］.結合實驗結果，提示尿囊酸酶與pstB細胞的分化有著密切的關系.綜上所述，細胞開始分化發(fā)育后，在前柄細胞中尿囊酸酶的表達一直多于前孢子細胞，由于前柄細胞亞型分化開始，在前柄細胞內熒光強弱出現(xiàn)變化，在pstB細胞中表達量逐漸增多.因此細胞發(fā)育的不同時期尿囊酸酶蛋白在不同類型細胞中的表達有差異，說明該蛋白定位表達與細胞類型分化有著密切的關系.

3.2 關于尿囊酸酶在兩種類型的細胞中表達量的初步分析

對尿囊酸酶在兩種類型盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中的表達情況進行比較發(fā)現(xiàn)，盡管尿囊酸酶在KAx-3多細胞發(fā)育過程中一直都有表達，但其呈現(xiàn)出與發(fā)育過程相關的變化趨勢.在發(fā)育前18 h，尿囊酸酶的表達量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，至18 h表達量最多，隨后尿囊酸酶的表達量急劇下降，此時正處于子實體的形成階段.子實體是由纖維化的柄支持著大量的休眠孢子，分析認為導致尿囊酸酶急劇下降的原因有二：一是細胞發(fā)育至子實體階段，柄細胞開始發(fā)生凋亡逐步成為死細胞，尿囊酸酶蛋白的表達量逐漸減少；二是前孢子細胞開始發(fā)育成成熟的孢子，孢子細胞是休眠細胞，新陳代謝處在很低的水平，所以隨著前孢子細胞分化的進行，細胞的新陳代謝也逐漸減慢，結果導致了尿囊酸酶蛋白含量的下降.雖然在AK127多細胞發(fā)育過程中尿囊酸酶蛋白一直都有表達，但是發(fā)育8 h時后尿囊酸酶的表達量不升反降，并在一個相對較低的范圍內波動.從實驗結果中可看到KAx-3細胞和AK127細胞中尿囊酸酶的表達趨勢有明顯差別.AK127是LagC基因被剔除的細胞，其發(fā)育只能停滯在細胞松散聚集階段，不能完成整個發(fā)育過程.LagC基因編碼膜蛋白gp150分子，而gp150是通過異噬性相互作用來調節(jié)盤基網(wǎng)柄菌多細胞的發(fā)育［11］.這也就意味著gp150的缺失影響了尿囊酸酶的表達，而且據(jù)報道gp150是在多細胞發(fā)育10 h后才開始表達的［12］.KAx-3細胞發(fā)育10 h后，尿囊酸酶的表達量明顯增加，這與gp150蛋白的表達時間存在一定的相關性.與此相反，AK127細胞除了在發(fā)育8 h時，作為一種補償效應，尿囊酸酶的表達突然上升外，其他時間段都在一個較低的表達范圍內波動，與KAx-3細胞中尿囊酸酶的表達有明顯差別.因此，尿囊酸酶的表達受到了gp150的影響，但是兩者間是直接地相互影響，還是間接地相互影響，尚不清楚，需要做進一步的研究.

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Quantitation and localization of allanoicase during the development of Dictysotelium discoideum

DAI Hui， HOU Lian-sheng

（School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

Location and expression of allanoicase were observed in the wild type KAx-3 and mutant type AK127 cells during development by immunofluorescent technique and Western blot，respectively.The results showed that abundant of allanoicase existed near the cytomembrane at the aggregation stage.At the mound stage，the fluorescence of allanoicase in the peripheral cells of mound was stronger than other place cells.When they developed into slug stage，more allanoicase existed in prestalk cells than that in prespore cells.The fluorescence of allanoicase expressed strongly at the junction of prespore area and prestalk area at the fruiting body stage，these cells would differentiate into prestalk B cells.These data indicated that there may be somerelationships between the expression of allanoicase and cell-type differentiation during Dictysotelium discoideumdevelopment.The results of western blot showed that the expression of allanoicase increased gradually in the development of KAx-3 cells.The expression amount of allanoicase was maximum when the cells developed nearly18 h.But the expression of allanoicase in AK127 cells which gene of gp150 protein was knocked out was always at a low level.It shows that the expression of allanoicase would be affected in the absence of gp150.The results indicate that the expression of allanoicase has some relationships with the developmental time of the cells，and is also associated with the expression of gp150 gene.

allanoicase； quantitative analysis； orientation observation； gp150

Q959.11

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2012.04.008

1000-5641（2012）04-0061-06

2011-05

國家自然科學基金（30970316，30670266）

代卉，女，碩士研究生.

候連生，男，教授，研究方向為細胞粘附分子和細胞信號轉導.E-mail：lshou＠bio.ecnu.edu.cn.