王 芳, 陳 炯, 史雨紅, 陸新江, 李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實室, 浙江 寧波 315211)

梅氏新貝尼登蟲(Neobenedenia melleni)是一種海水魚類體表寄生蟲, 其宿主專一性低，且分布范圍廣, 寄生于高體鰤(Seriola dumerili)、大黃魚(Pseudosciaena crocea)及日本黃姑魚(Argyrosomus japonicus)等百余種海水魚類的體表、眼、鰭、鰓和鼻等部位(Stephen et al, 2002; Whittington & Horton,1996; Zhang et al, 2002), 以宿主的表皮細胞和血液為食, 導(dǎo)致寄主寄生部位潰爛, 繼發(fā)細菌感染而死。梅氏新貝尼登蟲生活史可簡單劃分為3個典型的生理發(fā)育時期, 帶殼蟲卵需5～7 d孵化成鉤毛蚴;鉤毛蚴逸出6 h后感染性大幅降低, 寄生于魚體表后鉤毛蚴發(fā)育為成蟲; 成蟲存活周期一般為14～16 d (Jahn & Kuhn, 1932; Li et al, 2002)。我國東南沿海梅氏新貝尼登蟲病的流行和爆發(fā)有典型的季節(jié)特征, 夏秋季感染率最高, 冬季不感染。研究表明魚類貝尼登蟲的感染與海水溫度關(guān)系最大, 其次為降水量(Yang et al, 2004), 可見海水表層溫度和鹽度是影響梅氏新貝尼登蟲生存的重要環(huán)境因素。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)能夠阻止蛋白變性, 參與蛋白質(zhì)的運輸、折疊、解折疊、多聚體的組裝和拆解以及錯誤折疊或聚集蛋白的降解(S?rensen et al, 2003), 在應(yīng)激狀態(tài)下, HSPs占細胞內(nèi)總蛋白的百分比能夠從常態(tài)時的 5%升高至15%或更高(Srivastava, 2002), 這類蛋白可能在保護寄生蟲免受應(yīng)激損傷時發(fā)揮重要作用(Salem et al,2001)。其中熱休克蛋白60 (HSP60)是一類主要分布于線粒體且在進化上高度保守的蛋白質(zhì)。它能夠與原核和真核生物細胞內(nèi)的大部分蛋白相連接(Borges & Ramos, 2005), 協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配。研究表明, HSP60是自身防御系統(tǒng)的預(yù)警信號(Ohashi et al, 2000), 其表達量可用于海洋無脊椎動物的應(yīng)激檢測 (Choresh et al, 2001)。鑒于HSP60在生命活動中的重要功能, 本文克隆獲得梅氏新貝尼登蟲HSP60 (NmHSP60)全長基因, 選擇梅氏新貝尼登蟲生活史中持續(xù)時間較長的蟲卵和成蟲階段, 分別用RT-qPCR和Western blot技術(shù)分析該基因 mRNA及蛋白表達與溫度應(yīng)激和鹽度脅迫的相關(guān)性, 為 NmHSP60功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

于浙江省寧波市象山黃避岙港灣采集大黃魚樣本并分離體表梅氏新貝尼登蟲。成蟲和蟲卵分別置于鹽度24溫度為18、25及32 ℃的過濾海水中, 2 h后收集并液氮速凍保存, 各溫度樣品單獨重復(fù)取樣3次。取成蟲與蟲卵分別置于25 ℃鹽度為18、24及30的過濾海水中, 5 h后收集, 液氮速凍后?70℃保存, 各鹽度樣品單獨重復(fù)取樣3次。

RNAiso 試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自TaKaRa公司; Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司; BL21 pLys E和原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存; 辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG 購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和顯、定影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所; 引物合成及序列測定由上海英駿生物工程公司完成。

1.2 梅氏新貝尼登蟲NmHSP60基因cDNA全序列的獲得及分析

根據(jù)已知 HSP60的保守序列合成簡并引物HSP60-3F: 5'-GGNATGAARTTYGAYCGHGG-3'(N=A, C, G or T; R=A or G; Y=C or T; H=A, C or T), 以梅氏新貝尼登蟲混合樣cDNA為模板, 3'-RACE獲得NmHSP60基因cDNA的3'-端序列, 隨后根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計特異性引物 NmHSP60-5R: 5'-CGAAA GCGAAGCCCTGAC-3', 5'-RACE獲得NmHSP60基因cDNA的5'-端序列。測序結(jié)果經(jīng)過拼接及驗證重疊序列同一性后作 BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析。信號肽序列預(yù)測采用SignalP 4.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用InterProScan程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/), 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISSMODEL程序(http://swissmodel.expasy.org/repository), 多重序列比對和系統(tǒng)進化樹分析采用MEGA 4.0 軟件(Tamura et al, 2007)。

1.3 梅氏新貝尼登蟲應(yīng)激蟲卵與成蟲中NmHSP60基因mRNA的表達分析

用RNAiso試劑分別提取梅氏新貝尼登蟲各樣品的總 RNA, 加入 DNase I (RNase-free)處理, 在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下以總RNA 為模板合成cDNA第一鏈, 20 μL合成體系包括0.5 μg總RNA、4 μL的5× 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、2 μL的dNTP混合物(每種10 mmol/L)、20 U的 RNase抑制劑、50 pmol的Oligo(dT)18引物和10 U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)已知的NmHSP60基因cDNA序列設(shè)計RT-qPCR引物為NmHSP60F: 5'-CCGACGCTCTTAATGCTAC-3'和NmHSP60R: 5'-GGGCTTTCTTGACAATCTC-3',預(yù)期擴增片段大小為150 bp; 根據(jù)梅氏新貝尼登蟲內(nèi)參基因β-actin cDNA序列設(shè)計引物為Nm-actinF:5'-CTTTAGATTTCAACCAGGAG-3'和Nm-actinR:5'-TGCCACAGTATTCCCTTT-3', 預(yù)期擴增片段大小為 162 bp。RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同Huang et al (2011)。采用 2-??Ct法(Livak & Schmittgen,2001)對定量結(jié)果進行分析, 獲得 NmHSP60基因mRNA的相對表達量。

1.4 梅氏新貝尼登蟲 NmHSP60原核表達載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達和抗血清制備

根據(jù) NmHSP60基因的 ORF序列設(shè)計引物對pET-NmHSP60F:'(下劃線為添加的限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ的識別序列), 以梅氏新貝尼登蟲cDNA為模板擴增出NmHSP60基因ORF序列,PCR產(chǎn)物切膠純化后經(jīng)雙酶切插入pET-28a(+)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-NmHSP60。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 pLys E菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達, 12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE電泳分離,切膠純化預(yù)期大小的目的條帶, 免疫ICR小鼠制備抗血清, ?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 梅氏新貝尼登蟲應(yīng)激蟲卵與成蟲中NmHSP60蛋白表達變化分析

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 將NC膜浸入含5%脫脂奶粉的PBS-T中4 ℃封閉過夜; 一抗37 ℃搖床孵育2 h,PBS-T搖洗5次; 加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG, 37 ℃搖床孵育1 h, PBS-T搖洗5次;ECL發(fā)光法進行顯影, 膠片掃描后用Quantity One進行灰度統(tǒng)計。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果表示為 mean±SD, 采用 SPSS軟件(13.0)中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計, P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 梅氏新貝尼登蟲 NmHSP60基因序列及結(jié)構(gòu)分析

NmHSP60 基因全長cDNA序列(EMBL登錄號FN908505)包含1 882個核苷酸, 起始密碼子ATG位于第38～40位, 終止密碼子TAA位于第1 766～1 768位, 推測編碼一個由576個氨基酸組成的分子量為 6.15×104的蛋白, N-端無信號肽, 其理論等電點為 5.23。NmHSP60基因氨基酸序列包含一個伴侶素HSP60家族標記性位點(AAVEEGIVPGGG, aa 426—437)和一個位于 C端的 GGM 重復(fù)區(qū)域(GG MGGMGGMGGMGGMGGMGGMM, aa 555—576)。三維結(jié)構(gòu)分析表明, NmHSP60含有頂端結(jié)構(gòu)域(apical domain)、中間結(jié)構(gòu)域(intermediate domain)和赤道結(jié)構(gòu)域(equatorial domain)等3個典型HSP60蛋白結(jié)構(gòu)域, 其中赤道結(jié)構(gòu)域包含ATP結(jié)合位點及K+、Mg2+結(jié)合位點(Simons et al, 2004; Arnold et al,2006; Schwede et al, 2003; Guex et al, 1997)。

全長氨基酸序列比對結(jié)果表明, NmHSP60與曼氏血吸蟲HSP60的同一性最高, 達79%。氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析揭示, NmHSP60與曼氏血吸蟲、日本血吸蟲HSP60緊密成簇, 與其他物種進化關(guān)系較遠(圖 1)。

2.2 梅氏新貝尼登蟲應(yīng)激蟲卵與成蟲中NmHSP60基因mRNA的表達分析

梅氏新貝尼登蟲病爆發(fā)期采樣海區(qū)水溫通常為～25 ℃ , 本文以25 ℃為對照溫度對蟲卵和成蟲階段分別進行冷刺激(18 ℃ )和熱刺激(32 ℃ )處理。RT-qPCR結(jié)果顯示, 蟲卵階段 NmHSP60基因mRNA表達量在冷刺激下降低至對照溫度時表達量的 0.25, 在熱刺激下其表達量無顯著變化，而成蟲階段NmHSP60基因mRNA表達量在冷刺激下降低為對照溫度時的 0.45, 在熱刺激下則升高至對照溫度的1.3倍(圖2A)。

梅氏新貝尼登蟲病爆發(fā)期采樣海區(qū)海水鹽度通常為24左右。本文以鹽度24為對照, 選擇梅氏新貝尼登蟲蟲卵和成蟲做低鹽(鹽度 18)和高鹽(鹽度30) 脅迫。RT-qPCR結(jié)果顯示, 在低鹽脅迫下蟲卵階段NmHSP60基因 mRNA表達量無顯著變化,在高鹽脅迫下其表達量顯著上調(diào)為對照鹽度時的3.19倍; 成蟲階段NmHSP60基因mRNA在低鹽脅迫下表達量顯著降低, 約為對照鹽度時表達量的0.41, 在高鹽脅迫下無顯著變化(圖2B)。

2.3 梅氏新貝尼登蟲 NmHSP60基因的原核表達和其抗血清特異性Western blot檢測

經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的 pET28a-NmHSP60在 E.coli BL21 pLys E中融合表達 (圖3A)。Quantity One軟件分析表明, 該融合蛋白的相對分子質(zhì)量為6.4×104, 與預(yù)期的 6.38×104(包含 6.15×104的NmHSP60和0.23×104融合肽段部分)相符。Western blot分析表明（圖3B), 原核表達融合蛋白能夠與抗體發(fā)生特異性反應(yīng), 證實該表達產(chǎn)物為預(yù)期產(chǎn)物,在成蟲總蛋白中檢測到的條帶比融合表達蛋白略小, Quantity One軟件分析其相對分子質(zhì)量為6.15×104, 與理論計算分子量一致。

2.4 梅氏新貝尼登蟲應(yīng)激蟲卵與成蟲中NmHSP60蛋白表達變化分析

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖 4), 蟲卵階段NmHSP60含量經(jīng)冷刺激處理后下調(diào)為對照溫度時的 0.49, 經(jīng)熱刺激處理后無顯著變化; 成蟲中NmHSP60含量經(jīng)冷刺激處理后下調(diào)至對照溫度時的0.60, 經(jīng)熱刺激處理后上調(diào)至對照溫度時的1.24倍。蟲卵階段NmHSP60蛋白量在低鹽脅迫下無顯著變化, 在高鹽脅迫下上調(diào)至對照鹽度時的1.54倍;成蟲中NmHSP60蛋白量在低鹽脅迫下降低為對照鹽度時的0.69, 在高鹽脅迫下無顯著變化。Western blot檢測結(jié)果表明, NmHSP60蛋白表達變化與上述mRNA的表達變化一致。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的動物HSP60全長氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of animal HSP60, based on neighbor-joining methodGenBank登錄號：人, HUMHSP60A; 黑猩猩, AK305549; 豬, JN007377; 大鼠, RNU68562; 非洲爪蟾, BC072058; 大西洋鮭, BT059657; 牙鲆,DQ250130; 赤點石斑魚, HQ141338; 金魚, DQ872653; 草魚, HQ153829; 黑腳硬蜱, XM_002433677; 南美斑潛蠅, AY845949; 蝶蛹金小蜂, FJ798092;岡比亞按蚊, XM_318461; 梅氏新貝尼登蟲, FN908505; 曼氏血吸蟲, XM_002572286; 日本血吸蟲, AY813151。GenBank Accession numbers: Homo sapiens, HUMHSP60A; Pan troglodytes, AK305549; Sus scrofa, JN007377; Rattus norvegicus, RNU68562; Xenopus laevis, BC072058; Salmo salar, BT059657; Paralichthys olivaceus, DQ250130; Epinephelus akaara, HQ141338; Carassius auratus, DQ872653;Ctenopharyngodon idella, HQ153829; Ixodes scapularis, XM_002433677; Liriomyza huidobrensis, AY845949; Pteromalus puparum, FJ798092; Anopheles gambiae, XM_318461; Neobenedenia melleni, FN908505; Schistosoma mansoni, XM_002572286; Schistosoma japonicum, AY813151.

圖2 實時熒光定量PCR檢測NmHSP60基因mRNA表達變化Fig. 2 Expression changes analysis of NmHSP60 mRNA by RT-qPCRA：溫度脅迫; B：鹽度脅迫。A: Thermal stress challenge; B: Salinity stress challenge. *P＜0.05 (n=3).

3 討 論

本文測定了 NmHSP60基因全長 cDNA序列,推測編碼一個由576個氨基酸組成的分子量為6.15×104的蛋白, 該預(yù)測蛋白具有線粒體分子伴侶蛋白的典型特征。氨基酸序列同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析揭示, NmHSP60與曼氏血吸蟲HSP60較相似。

梅氏新貝尼登蟲在加勒比海、西大西洋、太平洋東部和中部以及紅海海域均有分布(Whittington& Horton, 1996), 在水溫為 19 ℃(Deveney et al,2001)和30 ℃(Li et al, 2002)時均有報道, 但迄今為止在寒帶海域未有發(fā)現(xiàn), 其蟲卵在 25 ℃時孵化率最高, 低水溫(18 ℃)和高水溫(32 ℃)時孵化率均驟減 (Lin et al, 2008)。本文研究表明, 18 ℃時蟲卵NmHSP60的表達顯著低于 25 ℃時, 32 ℃時表達略低于 25 ℃時, 但兩者無顯著差異; 成蟲NmHSP60的溫度應(yīng)激表達模式與蟲卵中的略有差異, 它隨溫度的升高表達顯著上升, 32 ℃時表達量顯著高于25℃時, 揭示NmHSP60表達與環(huán)境溫度應(yīng)激相關(guān)。前人研究表明, 正常條件下HSP60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于細胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中, 當機體受到脅迫時, HSP60表達量增加, 以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白(Langer & Neupert, 1991; Itoh et al,2002), 而 HSP60表達量的驟減會導(dǎo)致部分變性及不可溶的凝聚蛋白無法重新恢復(fù)天然構(gòu)象, 從而影響機體的正常生命活動(Gong & Yu, 2004), 當應(yīng)激過強引起 HSP60生理缺失時, 酵母會停止生長(Hallberg et al, 1993)。因此, 結(jié)合梅氏新貝尼登蟲的分布和發(fā)病規(guī)律, 我們認為 NmHSP60可能參與梅氏新貝尼登蟲在高溫下生理功能的維持。

圖3 NmHSP60基因的原核表達和抗血清Western blot檢測Fig. 3 Prokaryotic expression and Western blot analysis ofNmHSP60A：重組NmHSP60的SDS-PAGE分析; B：Western blot 分析。M：低分子量蛋白Marker(×103); 1-2：重組質(zhì)粒pET28a-NmHSP60在BL21 pLys E中誘導(dǎo)0 h、3 h的表達; 3：切膠純化蛋白; 4：陰性對照; 5：原核表達純化產(chǎn)物; 6：成蟲總蛋白。A: SDS-PAGE analysis of recombinant NmHSP60; B: Western blot analysis.M: protein molecular weight standards; 1-2: total protein of BL21 pLys E/pET28a-NmHSP60- induced for 0 h, 3 h; 3: purified recombinant NmHSP60; 4: negative control; 5: purified recombinant NmHSP60; 6: total protein of adult N. melleni.

圖4 Western blot檢測NmHSP60蛋白表達變化Fig. 4 Expression changes analysis of NmHSP60 by Western blotA: 溫度脅迫; B: 鹽度脅迫。A:Thermal stress challenge; B:Salinity stress challenge. *P＜0.05 (n=3).

水生生物會面臨滲透脅迫問題, 前人對梅氏新貝尼登蟲蟲卵和成蟲對環(huán)境鹽度的適應(yīng)性也做了一些研究, 發(fā)現(xiàn)海水鹽度為17.6～56.9時對蟲卵發(fā)育沒有顯著影響(Lin et al, 2008), 但成蟲對鹽度的變化敏感, 暴雨等造成的鹽度暫時性改變能導(dǎo)致成蟲從宿主體表脫落(Lin et al, 2008; Yang et al,2004)。新近研究表明, HSP60可能參與調(diào)節(jié)梭子蟹(Portunus trituberculatus)在鹽度脅迫下的應(yīng)激響應(yīng)(Xu & Qin, 2012)。本文研究表明, 蟲卵NmHSP60在鹽度18和24時表達無顯著性差異, 但鹽度升至30時, 表達量顯著增加, HSP60高表達與鹽度脅迫相關(guān)(Xu & Qin, 2012), 所以雖然表觀上鹽度為18～30是對蟲卵發(fā)育無顯著性影響(Lin et al, 2008),但較高的環(huán)境鹽度可能對蟲卵仍有脅迫作用,NmHSP60的高表達可能是蟲卵適應(yīng)高鹽環(huán)境的保護機制之一; 成蟲NmHSP60在鹽度18時表達顯著低于鹽度24時, 而鹽度升至30時表達與鹽度24時無顯著變化, 揭示成蟲 NmHSP60表達量與成蟲對低鹽敏感及高鹽耐受的表征具有一定的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述, NmHSP60是梅氏新貝尼登蟲一個重要的應(yīng)激相關(guān)因子。它在寄生蟲溫度和鹽度等環(huán)境應(yīng)激中的作用分子機制將有待進一步研究。