王金煥, 蘇 榕, 蘇偉婷, 成 誠, 魏曙光, 丁海華, 段 英, 李生斌, 佴文惠,*

(1. 中國科學(xué)院昆明動物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223;2. 西安交通大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院, 陜西 西安 710061; 3. 國家林業(yè)總局, 陜西省林業(yè)廳, 陜西 西安 710082)

朱鹮 (Nipponia nippon)屬鸛形目(Ciconiiformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮屬(Nipponia), 是世界級珍稀瀕危物種, 國家 I級重點(diǎn)保護(hù)鳥類。朱鹮曾經(jīng)廣泛分布于日本、朝鮮半島、中國和俄羅斯西伯利亞西南部。然而, 20世紀(jì)中葉以來, 由于環(huán)境污染、全球氣候變暖、捕獵和人類活動等因素的影響, 朱鹮的數(shù)量急劇減少, 野生種群在日本、朝鮮半島和俄羅斯的分布地區(qū)先后消失。中國自從 1964年在甘肅康縣采集到一只標(biāo)本后, 直到 1981年的近 20年一直沒有朱鹮的報(bào)道（Ding, 2004)。1981年野生朱鹮種群(7只)在陜西洋縣被重新發(fā)現(xiàn)（Liu, 1981)。此后, 我國在朱鹮的保護(hù)和研究方面開展了大量的工作, 主要包括朱鹮生態(tài)生物學(xué)、保護(hù)生物學(xué)、遺傳學(xué)、解剖學(xué)、飼養(yǎng)繁殖、病理學(xué)、疾病防治以及保護(hù)管理和再引入等。由于國家的高度重視, 野生朱鹮及其棲息地得到了有效保護(hù), 野生種群數(shù)量不斷增加。同時, 朱鹮人工飼養(yǎng)繁殖也與野生種群的保護(hù)同步進(jìn)行。1989年, 北京動物園人工繁殖朱鹮在世界上首次獲得成功(Li, 1989)。隨后三個朱鹮人工種群分別在北京和陜西建立, 有力保證了朱鹮種群的恢復(fù)和發(fā)展。大量的研究工作也為朱鹮的科學(xué)保護(hù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)（Ding, 2004)。

野生動物的遺傳資源保護(hù), 除建立專門的保護(hù)機(jī)構(gòu)、制定相關(guān)法律和建立國家公園、自然保護(hù)區(qū)及易地保護(hù)外, 以深低溫(-196 °C)凍存動物的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞則為另一條有效的途徑(Shi, 1989)。細(xì)胞是生命的基本單位, 具有生命所有的遺傳信息。動物體細(xì)胞系的建立, 為從細(xì)胞和分子水平開展各類研究提供經(jīng)濟(jì)、方便的材料來源, 也為以后再建當(dāng)時或許已滅絕的物種提供材料儲備。迄今為止, 還沒有關(guān)于朱鹮體細(xì)胞成功建系的報(bào)道。對我國的朱鹮, Liu et al（1992)報(bào)道了兩只飼養(yǎng)于北京動物園的朱鹮的染色體性別鑒定及核型分析的結(jié)果,但未見朱鹮染色體G帶、C帶和Ag帶的報(bào)道。

本研究利用微創(chuàng)取樣方法, 在不對朱鹮造成致命傷害的前提下, 獲得其皮膚樣本, 成功建立了朱鹮的體細(xì)胞系, 并對該細(xì)胞系的體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定以及染色體G帶、C帶和Ag帶等進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料來源

雌、雄兩只成年朱鹮均來自陜西朱鹮人工繁殖中心。取材前徹底消毒背部皮膚, 用眼科剪剪下～0.5 cm×1 cm的一塊皮膚, 迅速放入運(yùn)輸培養(yǎng)基內(nèi)。動物行傷口縫合處理后放回飼養(yǎng)網(wǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)用運(yùn)輸液為含有100 U/mL青霉素鈉以及100 μg/mL 鏈霉素的DMEM(GIBCO); 生長液為含有 10%胎牛血清的 OPTI-MEM(GIBCO), pH 7.2～7.4; 培養(yǎng)器皿為培養(yǎng)面積 25 cm2的一次性塑料培養(yǎng)瓶(Corning)。

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 使用含兩倍雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌皮膚組織塊5次, 剪小至～1 mm; 加入0.25%胰酶(1:250,Amresco)0.5 mL消化0.5 min后迅速加入生長液抑制胰酶作用; PBS清洗一次后, 將組織塊貼至培養(yǎng)瓶瓶壁, 1 h后加入1 mL生長液, 37 °C培養(yǎng)24 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL; 此后每3天換液一次。待15 d后可見細(xì)胞開始從組織塊長出, 再培養(yǎng)5 d后即可傳代。

1.2.2 細(xì)胞傳代 待組織塊周圍細(xì)胞均長成致密的單層后即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去生長液, PBS清洗一次后加入0.25%胰蛋白酶1 mL, 37 °C消化1～2 min后加入5 mL新鮮生長液; 輕拍瓶壁分散細(xì)胞,補(bǔ)加生長液至15 mL后吸出一半至另外一個培養(yǎng)瓶(1:2傳代); 37 °C, 5% CO2條件下培養(yǎng), 待長成單層后, 再按上述方法傳代。

1.2.3 細(xì)胞凍存 用0.25%胰酶消化、收集對數(shù)生長期細(xì)胞, 離心后棄去上清液; 加入新鮮配制的凍存液[小牛血清 90%, 二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO, Amresco) 10%]制備成 2×106個/mL的細(xì)胞懸液, 每個凍存管分裝1 mL; 凍存管置于程序凍存盒(Nalgen)內(nèi), -80 °C過夜后, 移入液氮內(nèi)長期保存。

1.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出凍存管后迅速放入37 °C水浴中, 讓細(xì)胞在1～2 min內(nèi)完全融化;在無菌環(huán)境下將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi), 37 °C, 5%CO2條件下培養(yǎng)。3 d后細(xì)胞即可長成單層。

1.3 細(xì)胞生長評價(jià)

參照Mosmann (1983)的方法, 測定5、10、20和25代的細(xì)胞生長率。細(xì)胞按1×104個/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi), 每孔接種180 μL。37 °C培養(yǎng)24 h后, 每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT[3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5)-dimethylthiazol (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, Sigma], 重復(fù)做 5個孔 。繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,小心吸出上清, 每孔加入150 μL的DMSO, 10 min后, 于振蕩器上振搖 10 min, 并在酶標(biāo)儀(BIORAD-680)上測定570 nm波長下的吸光度值(optical density value, OD)。以后每天按此方法測定5孔細(xì)胞的OD值, 連續(xù)測定7 d。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.4 免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞來源

將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到置于6孔板內(nèi), 且已滅菌的7 mm×22 mm蓋玻片上, 培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液, 用冰冷的PBS漂洗3次; 4%的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞 15 min, 用含 0.03% Triton-100的PBS (PBST) 漂洗3次, 每次5 min; 加入1% BSA(bovine serum albumin, 牛血清白蛋白, Amresco)室溫封閉20 min, PBS漂洗3次, 每次5 min; 分別加鼠抗人波形蛋白和鼠抗人平滑肌α-actin (肌動蛋白)單克隆抗體(1:200, Dako), 4 °C孵育過夜; PBS漂洗細(xì)胞3次, 每次3 min, 加入Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗, 37 °C孵育30 min; PBST漂洗3次, 每次5 min, 用含 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma) 的封片液封片后, 熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.5 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

1.5.1 染色體標(biāo)本制備 在細(xì)胞對數(shù)生長期, 每10 mL 培養(yǎng)液加入 20 μL 秋水仙素(100 μg/mL,Sigma), 處理細(xì)胞 60 min后棄去培養(yǎng)液; 用0.25%胰酶消化細(xì)胞 1～2 min, 然后加入適量的生長液抑制胰酶作用; 混勻細(xì)胞懸液, 離心后棄上清,用0.075 mol/L KCl溶液低滲處理細(xì)胞15 min, 離心后加入甲醇:冰乙酸(3:1)固定細(xì)胞3次; 以空氣干燥法制片。

1.5.2 染色體帶型分析 參照 Seabright (1971),Summer (1972) 和 Goodpasture & Bloom (1975)的方法進(jìn)行G帶、C帶和Ag帶顯示。

1.5.3 熒光原位雜交 參照Nie et al (2009) 的方法,利用石鸻 (Burhinus oedicnemus, 鸻形目) 的 Z和W 染色體特異探針與朱鹮的中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交, 鑒別朱鹮的性染色體。

1.6 圖像拍攝與分析

用裝有 CCD攝像裝置的蔡司熒光顯微鏡(Axioplan 2, Zeiss company)和圖像分析軟件(CytoVision system, Applied Imaging Corp, UK)進(jìn)行圖像拍攝和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 朱鹮皮膚細(xì)胞系的建立

在陜西朱鹮人工繁殖中心獲得兩只朱鹮(雌、雄各一只)的皮膚樣品后, 置于運(yùn)輸液中運(yùn)送到昆明。原代培養(yǎng) 15 d后, 有細(xì)胞從組織塊周圍長出(圖 1 A), 繼續(xù)培養(yǎng)5 d后細(xì)胞長成致密單層(圖1 B), 即可以 1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng), 以維持細(xì)胞增殖。我們對 10代以前不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存,成功建立了兩株朱鹮細(xì)胞系, 分別命名為 KCB 201253S（雄性)和KCB 2012055S（雌性)。細(xì)胞均為典型的成纖維樣細(xì)胞, 且支原體污染檢測（熒光法)結(jié)果均為陰性。凍存的朱鹮細(xì)胞在復(fù)蘇后能夠正常生長, 且生長速度與凍存前相比并未減低。

圖1 培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 Morphology of N. nippon cultured cells

為優(yōu)化培養(yǎng)條件, 我們選用了不同的培養(yǎng)基如DMEM、MEM和OPTI-MEM (GIBCO)同時培養(yǎng)朱鹮細(xì)胞, 并添加相同比例牛血清, 經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)OPTI-MEM培養(yǎng)基最適宜朱鹮細(xì)胞的生長。

為鑒別所建立的朱鹮細(xì)胞系的來源, 我們采用免疫熒光染色的方法, 用兩種不同的抗體對培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞進(jìn)行免疫抗體染色。 結(jié)果顯示在朱鹮細(xì)胞中鼠抗人波形蛋白抗體染色為陰性, 而鼠抗人平滑肌α-actin抗體染色為強(qiáng)陽性(圖2, 呈束狀的紅色熒光顯示肌絲特征)。鼠抗人平滑肌 α-actin抗體只與血管平滑肌細(xì)胞中的actin的α異構(gòu)體特異性結(jié)合, 而與成纖維細(xì)胞中的β-、γ-actin均不能結(jié)合。因此該抗體可以作為血管平滑肌細(xì)胞的鑒定(Cai et al, 2005)。免疫熒光染色的結(jié)果提示我們建立的朱鹮細(xì)胞系來源于血管平滑肌組織。體外培養(yǎng)細(xì)胞源于動物機(jī)體, 而機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長, 每一種組織都有血管和間葉組織, 因此, 由動物體來源的培養(yǎng)材料而進(jìn)行的原代培養(yǎng), 絕大多數(shù)都呈各種細(xì)胞混合生長（Zhou, 2006)。我們所取的朱鹮皮膚樣品中也含有血管, 在剪小的組織塊中包含有血管平滑肌組織, 在原代培養(yǎng)時包括血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的各類細(xì)胞均可從組織塊中長出, 因此, 可能在后續(xù)的傳代培養(yǎng)過程中, 血管平滑肌細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞而保留下來。

圖2 朱鹮細(xì)胞的平滑肌肌動蛋白抗體免疫熒光染色Fig. 2 Immunofluorescence staining of smooth muscle special actin in N. nippon fibroblast cells

2.2 朱鹮細(xì)胞生長特性分析

利用MTT法, 我們測定了連續(xù)培養(yǎng)7 d的不同傳代數(shù)的朱鹮細(xì)胞生長情況。 圖3為5、10、20和 25代朱鹮細(xì)胞的生長曲線。體外培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞表現(xiàn)出了典型的“潛伏期—對數(shù)生長期—停滯期”的生長模式。在細(xì)胞傳代過程中, 我們發(fā)現(xiàn)不同代數(shù)細(xì)胞的增殖能力和形成單層的時間有所不同。傳代數(shù)＜10的細(xì)胞, 輪廓清晰、立體感強(qiáng)且增殖能力強(qiáng), 3 d即可形成致密單層; 傳代數(shù)＞15的細(xì)胞, 形成單層的時間逐漸延長, 到20代以后, 細(xì)胞增殖能力明顯減慢, 5 d才可形成單層; 傳代數(shù)＞25的細(xì)胞,形態(tài)扁大, 顯現(xiàn)衰老特征且不能再形成單層。因此,我們所建立的朱鹮細(xì)胞系為有限細(xì)胞系, 為保證細(xì)胞的旺盛生長力, 需在建系早期多凍存?zhèn)鞔鷶?shù)低的細(xì)胞, 且要避免長時間連續(xù)傳代細(xì)胞。

圖3 不同傳代數(shù)的朱鹮細(xì)胞生長曲線Fig. 3 Growth curves of N. nippon cells of different passages

2.3 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

為證實(shí)我們所建立的細(xì)胞系確實(shí)來源于朱鹮,排除培養(yǎng)過程中可能發(fā)生的細(xì)胞交叉污染, 我們制備了這兩株培養(yǎng)朱鹮細(xì)胞的中期染色體, 并進(jìn)行了以下細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

染色體數(shù)目和形態(tài) 鳥類染色體所具有的大量微小染色體在使用Giemsa染液染色時著色較淺(圖4A), 在染色體分散不理想時不易計(jì)數(shù)。為了準(zhǔn)確計(jì)數(shù)微小染色體, 我們采用能使所有鳥類染色體均勻著色的熒光染料碘化丙啶 (propidium iodine, PI,Amresco) 對所制備的中期染色體進(jìn)行染色(圖4B)。對100個中期分裂相的計(jì)數(shù)結(jié)果表明, 細(xì)胞的染色體眾數(shù)為2n=68, 包括性染色體在內(nèi)有10對大染色體, 其余為微小染色體。我們的結(jié)果與Liu et al（1992)報(bào)道的朱鹮核型分析結(jié)果一致, 證明我們所建立的細(xì)胞系確實(shí)來源于朱鹮。

帶型分析 目前, 有關(guān)朱鹮顯帶染色體未見報(bào)道。在本研究中, 我們首次進(jìn)行了朱鹮染色體 Ag帶、C帶(圖4C, D)和G帶(圖5)顯示。在所觀察的20個細(xì)胞中, 銀染的核仁組織者區(qū)(nucleolar organizer region, NOR)分布在一對微小染色體上(圖4C, 箭頭所示)。C帶(異染色質(zhì))主要分布在多數(shù)大染色體的著絲粒區(qū)域, 微小染色體多為 C帶陽性,表明其微小染色體含有豐富的異染色質(zhì)。W染色體和Z染色體的長臂末端均為C帶陽性(圖4D, 箭頭所示)。朱鹮的染色體 C帶與已報(bào)道的家雞的染色體C帶相似(Pollock & Fechheimer, 1981)。圖5為朱鹮的 G帶核型圖, 染色體排列方式參照 Liu et al(1992)的報(bào)道, 按染色體的相對長度, 從長到短進(jìn)行排列。G帶分析結(jié)果表明, 除雌性性染色體為異配的ZW以及雄性性染色體為同配的ZZ外, 雌、雄個體的G帶核型一致; Z染色體為中著絲粒染色體, 相對長度僅次于第5號染色體; W染色體長度約為Z染色體的一半。這些結(jié)果與Liu et al(1992)的報(bào)道一致。雖然可以根據(jù)性染色體為同配或異配來鑒別鳥類的性別, 但鳥類的W染色體較小, 長度與一些較小的常染色體相當(dāng), 因此, 在常規(guī)染色的分裂相中, 僅根據(jù)外形, 很難準(zhǔn)確鑒別 W 染色體(Shields,1982)。對于朱鹮W染色體的形態(tài), Takasi &Sasaki（1974)的報(bào)道為亞端著絲粒染色體, Liu et al（1992)認(rèn)為是中著絲粒染色體, 而我們的G帶核型分析支持其為亞端著絲粒染色體（圖5)。

圖 4 不同染色和顯帶的朱鹮染色體Fig. 4 Examples of N. nippon chromosomes with different staining and banding

圖5 朱鹮的G帶核型Fig. 5 G-banded karyotype of N. nippon

朱鹮性染色體鑒別 在以前的研究中, 通過流式分選, 我們已獲得了石鸻 (B. oedicnemus, 鸻形目)的Z和W染色體特異探針(Nie et al, 2009)。為準(zhǔn)確鑒別朱鹮的性染色體, 特別是W染色體, 我們利用石鸻的Z和W染色體特異探針, 分別與雄、雌性朱鹮的中期分裂相進(jìn)行熒光原位雜交(圖6A, B)。在雄性朱鹮的中期分裂相中, 石鸻的Z染色體探針涂染了一對中著絲粒染色體(圖 6A), 即 Z染色體,與核型分析確定的Z染色體一致。在雌性朱鹮的中期分裂相中, 石鸻的 W 染色體探針涂染了一條較小的亞端著絲粒染色體(圖6B), 直接證明W染色體是一條較小的亞端著絲粒染色體(圖 6C)。另外, 石鸻的Z和W染色體探針分別在朱鹮的一對微小染色體和Z染色體長臂的末端有交叉雜交的信號。這種交叉雜交的信號, 在以石鸻的Z和W染色體探針與家雞的中期分裂相進(jìn)行熒光原位雜交的實(shí)驗(yàn)中也曾被檢測到(Nie et al, 2009), 表明石鸻的Z和W染色體探針中包含有與被雜交的染色體同源的序列, 這些同源的序列可能是重復(fù)序列。

圖6 熒光原位雜交示例Fig. 6 Examples of fluorescent in situ hybridization

近期, 西安交通大學(xué)和華大基因已合作完成了朱鹮全基因組序列圖譜繪制。朱鹮體細(xì)胞系的成功建立, 不僅保存了這一珍稀瀕危鳥類的遺傳資源,也為后續(xù)開展其基因定位和其它生物學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。在本研究中所建立的朱鹮體細(xì)胞培養(yǎng)的方法, 也可以用于其他鳥類的體細(xì)胞系建立和保藏。

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