鄭金珠，劉翻，孫元社，唐濤，張維冰，李彤

（1.齊齊哈爾大學， 黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2.上海市功能性材料化學重點實驗室，華東理工大學， 上海 200237； 3.大連依利特分析儀器有限公司， 遼寧 大連 116023；4.遼寧大連依利特分析儀器工程技術研究中心， 遼寧 大連 116023）

隨著人們物質生活水平的提高，啤酒已經(jīng)成為餐桌上不可缺少的一部分，其中的胺類物質與其質量密切相關[1]，故啤酒中胺類物質的種類和數(shù)量對于區(qū)分不同種類不同品牌的啤酒以及辨別假冒偽劣產(chǎn)品具有重要的參考價值。啤酒中還可能有含強致癌性的亞硝胺類化合物[2,3]，控制其在啤酒中的含量對人們的身體健康具有重要意義。

胺類物質的檢測方法包括薄層色譜法、離子色譜法、毛細管電泳、電化學法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[4,5]，卓平等人[6]采用高效液相色譜法同時測定水產(chǎn)品中10種生物胺，檢測限為μg/g。但啤酒中許多胺類物質含量極低，常規(guī)方法很難進行直接分離和檢測，激光誘導熒光檢測器(LIFD)作為目前靈敏度最高的檢測技術之一[7]，在痕量物質檢測方面具有無可比擬的優(yōu)勢[8]，劉春鳳等人[9]采用FITC衍生激光誘導熒光法與毛細管電泳偶聯(lián)法檢測啤酒中的14種生物胺，結果顯示不同種類的啤酒中生物胺的種類和含量均不相同。

本文以FITC為衍生試劑，對啤酒進行衍生，以HPLC-LIFD系統(tǒng)對啤酒中胺類物質進行分析，同時采用真空低溫蒸餾結合GC-FID法對啤酒中4種不能用FITC衍生的揮發(fā)性的亞硝胺類化合物進行了測定，發(fā)展了啤酒中胺類物質的高靈敏度和高選擇性的分析方法，并使用該方法考察了市場上多種啤酒中胺類物質種類和含量的差異。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：激光誘導熒光檢測器（大連依利特分析儀器有限公司）；GC7890Ⅱ氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測器（上海天美科學儀器有限公司）。

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC )(98%，Sigma)；N-亞硝基二乙胺（NDEA，98.5%）、N-亞硝基二丁胺（NDBA，98.5%）、N-亞硝基哌啶( NPIP，99%)和N-亞硝胺吡咯烷(NPYR，98.5%)均購自Fluka公司；實驗用水均為milli-Q過濾超純水；啤酒樣品均于市場購買。

1.2 樣品前處理

1.2.1 衍生過程（HPLC-LIFD法）

量取5μmoL/L的FITC 60μL,加入340μL 50mmol/L磷酸鈉緩沖溶劑（pH=11），然后與100μL啤酒樣品混合均勻，避光衍生6h后加入500μL水，直接進樣分析。

1.2.2 真空低溫蒸餾(GC-FID法）

參照GB/T 5009.26-2003[10]中真空低溫蒸餾法，同時加大前處理量后對啤酒中亞硝胺類物質進行提取和富集：量取150mL啤酒，超聲脫氣后加入8mL氫氧化鈉溶液（1mol/L），在真空度約為53KPa下蒸餾至約10mL，再將真空度調至約95KPa，直至近干。然后往餾出液中加入8mL鹽酸（0.1mol/L）并混勻，用40mL二氯甲烷萃取三次，合并120mL萃取液用無水硫酸鈉除水后移入旋轉蒸發(fā)儀中，在（37±2）℃水浴下旋蒸濃縮至約5mL，再氮吹定容至0.5mL備用。

1.3 色譜條件

1.3.1 HPLC-LIFD

色譜柱：ODS2 5μm(4.6mm×150mm)；流動相：A10mmoL/L乙酸銨（pH=8.0～8.5），B乙腈，梯度洗脫程序：0～10min，6%～15%B；15～25min，15%～17% B；15～25min，17%～40%B；進樣量20μL，室溫下分析。

1.3.2 GC-FID

采用TM-1毛細管色譜柱（0.53 mm×30m×0.1μ m），初溫60℃，保持3min，10℃/min升至280℃保持5min；進樣口溫度250℃； 檢測器溫度250℃；載氣：氮氣，流速8mL/min；進樣量1μL。

2 結果與分析

2.1 HPLC-LIFD分析

2.1.1 方法建立

FITC衍生胺類物質時，一般需12h以上[11]，而Ming Du等人[12]研究發(fā)現(xiàn)FITC衍生生物胺時6h即達到平衡。以某品牌啤酒A為樣品，考察了FITC衍生時間分別為6、12、24、36、60h樣品在選定色譜條件下出峰情況。結果顯示衍生6h色譜峰峰數(shù)最多，而峰高變化無規(guī)律。綜合考慮出峰數(shù)量與峰高，選擇衍生時間為6h。

為得到更多樣品信息，各色譜峰盡量在整個色譜圖中分布均勻，對梯度條件進行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下以啤酒A為樣品連續(xù)進樣5次，考察方法穩(wěn)定性，結果表明該方法重復性良好。

2.1.2 實際啤酒樣品分析

市購11種不同品牌和同一品牌不同系列的啤酒樣品進行檢測，用FITC按照1.2.1方法進行衍生后，按照優(yōu)化后的色譜條件進樣分析，對啤酒中胺類物質的種類和相對含量進行考察，以峰高值1mV為積分閾值，計算樣品色譜圖中色譜峰數(shù)量。

實驗結果表明，11種啤酒樣品色譜峰在色譜圖中的分布具有一定趨勢：在5min～10min和15～23min大部分胺類物質的含量較低，10min～15min之間含量較高。同時不同啤酒樣品色譜圖中色譜峰數(shù)和峰高值差異較大。

圖1為某品牌啤酒B的四個系列分析色譜圖，從圖中可以看出，樣品B1-B4出峰數(shù)量和峰高均有一定差異。四種系列啤酒的出峰數(shù)分別為44、42、40和47。樣品B1的1號色譜峰和2號色譜峰高值遠高于其它三種，而在10min～15min樣品B2色譜峰峰高值高于其它兩種。

圖1 某品牌啤酒樣品B 4種系列檢測色譜圖（色譜條件見1.3.1）

圖2為4種不同品牌啤酒C-F，色譜峰數(shù)分別為51、38、38和48，樣品D的1號峰高值高于其它三種。而在10～20min之間，樣品C的峰高值高于其它三種。

圖2 4種不同品牌啤酒檢測結果（色譜條件見1.3.1）

圖3 3種不同品牌啤酒檢測結果（色譜條件見1.3.1）

圖3為3種不同品牌啤酒樣品G-I，色譜峰峰數(shù)分別為40、49和53，其中樣品I的1號峰和2號峰峰高值遠低于其它兩種，而在10～15min之間樣品H色譜峰峰高值遠高于其它兩種。

2.2 GC-FID分析N-亞硝基類化合物

2.2.1 方法建立

N-亞硝基類化合物具有強致癌性，不能用FITC衍生[13]，其分析一般使用靈敏度較高的熱能分析儀、質譜或氮磷檢測器[14-16]。本文采用靈敏度較低但使用更普遍的FID檢測器。

在1.3.2色譜條件下，NDEA、NDBA、NPIP和NPYR4種化合物在14min內全部出峰，且與雜質達到基線分離。同時以標準品對該方法進行了論證。結果表明4種化合物在0.005-0.1mg/mL范圍內具有良好的線性關系，方法檢出限達到μg/L。且方法穩(wěn)定，加標濃度為0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL時，4種物質回收率均在70～90%之間；加標濃度為0.08mg/mL時，平行5次實驗，NDEA、NDBA、NPIP、NPYR回收率RSD值分別為3.50%、2.27%、5.72%和7.56%。

2.2.2 實際樣品分析

以上述方法對超市購買3種不同品牌啤酒樣品進行分析，結果顯示（見圖4），3種啤酒中NPIP和NPYR均未檢出，樣品K中NDEA及NDBA的含量分別為20.00μg/L和29.55μg/L，樣品J含有22.01μg/L的NDEA。

圖3 3啤酒樣品中4種亞硝胺測定結果（色譜條件見1.3.2）

3 結 論

使用HPLC-LIFD與GC-FID結合，發(fā)展了一種啤酒中胺類物質的系統(tǒng)分析方法。以FITC為衍生試劑，對啤酒中含有-NH2和-NH-基團的胺類物質直接進行衍生，HPLC-LIFD分析，對市場上11種啤酒進行了分析。結果表明不同品牌啤酒中胺類物質的種類、數(shù)量及含量均存在一定差異，以峰高值1mV為積分閾值，出峰數(shù)從38至53之間不等。同時使用真空蒸餾GC-FID法對啤酒中4種具有特殊結構的亞硝胺類物質進行了分析，綜合評價啤酒總胺類物質的組成，在分析的3種啤酒其中兩種中檢測到微量亞硝胺類物質。該方法靈敏度高，穩(wěn)定性高，適用于啤酒及其它食品中胺類物質的分析，特別是痕量胺類物質的分析。對于食品中胺類物質的研究、假冒偽劣產(chǎn)品的辨別和產(chǎn)品質量監(jiān)控具有重要的參考價值。

[1]韓小江，張嘉捷，朱巖。浙江大學學報，2009,36(6): 687

[2]Andrade R, Reyes F G R, Rath S. Food Chemistry, 2005, 91: 173

[3]Yurchenko S, Molder U. Food Chemistry, 2007,100: 1713

[4]張劍，鐘其頂，熊正河等。啤酒科技，2010,7: 80-85

[5]Onal A. Food Chemistry, 2007, 103: 1475

[6]卓平，劉辰，陳迪等，分析測試學報，2006,25(4): 59

[7]Ramsay L M, Dickerson J A, Dada O, et al. Anal Chem, 2009,81(5): 1741

[8]Katzenmeyer J B, Eddy C V, Arriaga E A. Anal Chem,201082(19): 8113

[9]劉春鳳，李崎，啤酒科技，2007,113: 58-61

[10]GB/T 5009，26-2003. 食品中N-亞硝胺類的測定方法

[11]翟其曙，湯曉慶，胡效亞等，化學進展，2006,18(6): 791

[12]Du M, Flanigan V, Ma Y. Electrophoresis, 2004, 25: 1497- 1498

[13]幸苑娜，王欣，陳澤勇等，分析測試學報，2011,30(5):503-504

[14]陶燕飛，黃紅林，張?zhí)抑?，分析測試學報，2003，5(22)：82- 83

[15]Grebel J E, Young C C, Suffet(Mel)I H. Journal of Chromatography A, 2006, 1117: 11

[16]SáNCHEZ B J, BALLESTEROS E, GALLEGO M. Agric Food Chem. 2007, 55: 9758