林 璋 洪華山 林軍華 林曉紅 方美琴

石蠟切片行免疫熒光染色后再行PAS或HE染色確定NPR-A蛋白在腎臟的定位

林 璋1，2洪華山1＊林軍華1林曉紅1方美琴1

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福州，350003；2福建省老年醫(yī)院心血管內(nèi)科，福州，350001）

目的 介紹一種新方法來(lái)明確NPR-A蛋白在大鼠腎組織的定位。方法 采用腎臟石蠟切片先行NPR-A免疫熒光染色，然后再行PAS或HE染色。結(jié)果 NPR-A免疫陽(yáng)性物在大鼠腎組織主要沉積于皮質(zhì)的近端小管、外髓的髓袢升支粗段以及內(nèi)髓集合管，直小血管、腎小球、遠(yuǎn)曲小管和細(xì)段也有一定量的表達(dá)，而皮質(zhì)及外髓集合管僅有少量的表達(dá)。結(jié)論研究采用石蠟切片先行免疫熒光染色后再行PAS或HE染色，在不用或少用特異性抗體的情況下，成功的解決了NPR-A蛋白在大鼠腎組織表達(dá)的分布位置及細(xì)胞定位的難題。

A型利鈉肽受體；免疫熒光染色；腎臟；定位

組織蛋白的定位研究對(duì)于闡明其功能具有十分重要的意義，尤其對(duì)于科研工作者，常常需要對(duì)組織蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的定位。腎臟作為體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的器官之一，單純依靠免疫組織化學(xué)染色方法（包括免疫熒光法）來(lái)辨認(rèn)某些蛋白（抗原）在腎組織的分布位置以及細(xì)胞定位十分困難。A型利鈉肽受體 A（natriuretic peptide receptor-A，NPR-A），被認(rèn)為在腎臟具有廣泛的分布，然而對(duì)其在腎組織的分布位置及細(xì)胞定位，目前仍未完全闡明［1，2］。本研究介紹一種新方法，即采用石蠟切片先行免疫熒光染色，然后再行過碘酸雪夫-糖原染色（PAS染色）或蘇木素-伊紅染色（HE染色），明確NPR-A蛋白在大鼠腎臟的組織分布及細(xì)胞定位，旨在為科研工作者提供一種簡(jiǎn)單而有效地研究某些蛋白在腎組織內(nèi)定位的新方法。

材料和方法

1.動(dòng)物

健康成年雄性清潔級(jí)Sprangue-Dawly（SD）大鼠8只，體重300g-380g，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：2007000506477，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2007-0005；籠宿條件12h光照12h黑暗，濕度（24±1）℃，飼料、墊料高壓滅菌，飲用冷開水，自由攝食進(jìn)水，所有動(dòng)物研究全部符合國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》。

2.主要試劑和儀器

兔抗A型利鈉肽受體多克隆抗體（NPR-A）、鼠抗人腎母細(xì)胞瘤基因蛋白單克隆抗體（WT-1，足細(xì)胞核標(biāo)記性抗體）購(gòu)自Santa Cruz公司，枸櫞酸抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、OCT冰凍切片包埋劑、山羊抗兔Dy Light 488標(biāo)記的熒光Ig G和山羊抗鼠Dy Light 549標(biāo)記的熒光Ig G試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，冰凍切片機(jī)及倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：DMI3000）購(gòu)自德國(guó)Leica公司，自發(fā)熒光淬滅劑購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，HE染色試劑盒及PAS試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3.腎組織標(biāo)本采集、組織切片的制備以及實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠經(jīng)水合氯醛（0.3 ml／100g）腹腔注射麻醉成功后，用冷生理鹽水灌洗以除去腎臟血管內(nèi)血液直至變白后置冰上。取左腎，小心去除腎包膜，從腎蒂沿最大冠狀位縱形切成對(duì)半，各做冰凍切片和石蠟切片。冰凍切片的制作參照文獻(xiàn)［3］，取一半腎組織迅速置于4%多聚甲醛中4℃過夜固定，20%-30%蔗糖過夜沉底，OCT包埋劑包埋，液氮速凍，冰凍切片機(jī)上切取8μm厚的切片，37℃干燥2 h后放置于-80℃超低溫冰箱，備用。另一半腎組織置于10%福爾馬林固定液固定24 h后，組織塊經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，每個(gè)石蠟做連續(xù)切片（厚度2μm），備用。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組即采用石蠟組織行免疫熒光組織化學(xué)染色和對(duì)照組即采用冰凍組織行免疫熒光組織化學(xué)染色。

4.免疫熒光染色（冰凍切片）

參照 文 獻(xiàn)［4］，冰 凍 切 片 經(jīng) 4℃ 丙 酮 固 定 5-10 min，水 洗 后 入 0.1 mol／L Triton-X100 處 理10 min；PBS沖洗（3 min×3），除去PBS，滴加100ul正常山羊血清封閉液，室溫下孵育30 min；傾去血清，勿洗，滴加50ul的一抗 NPR-A（1∶50），置濕盒4℃孵育過夜。PBS沖洗（3 min×5），除去PBS，滴加50ul的山羊抗兔Dy Light 488（激發(fā)綠色熒光）標(biāo)記的熒光二抗（1∶200），室溫下避光孵育60 min；PBS沖洗（3 min×5），除去PBS，滴加100ul自發(fā)熒光淬滅劑，室溫下孵育1h，PBS沖洗（3 min×3），除去PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察。綠色熒光代表NPR-A陽(yáng)性產(chǎn)物。每張切片依次從皮質(zhì)、外髓外帶、外髓內(nèi)帶以及內(nèi)髓4處隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)高倍視野，每例重復(fù)3遍。

5.免疫熒光染色（石蠟切片）

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后高壓熱修復(fù)2 min，用PBS沖洗3次，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min；PBS沖洗（3 min×3），除去PBS，滴加100ul正常山羊血清封閉液，室溫下孵育30 min；傾去血清，勿洗，每張切片分別滴加50ul的兔抗大鼠NPR-A（1∶50），置濕盒4℃孵育過夜。PBS沖洗（3 min×5），除去PBS，每張切片分別滴加各50ul的山羊抗兔Dy Light 488（激發(fā)綠色熒光）標(biāo)記的熒光二抗（1∶200），室溫下避光孵育60 min；PBS沖洗（3 min×5），除去PBS，滴加100ul自發(fā)熒光淬滅劑，室溫下孵育1h，PBS沖洗（3 min×3），除去PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察。綠色熒光代表NPR-A陽(yáng)性產(chǎn)物。每張切片依次在皮質(zhì)、外髓外帶、外髓內(nèi)帶以及內(nèi)髓4處隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)高倍視野拍攝。結(jié)束后，將切片放入自來(lái)水沖洗20 min，去除蓋玻片并洗脫黏附在載玻片上的緩沖甘油，再將切片浸入p H4.7-5.0的50%乙醇中5 min，然后切片入水后按常規(guī)染色程序進(jìn)行HE染色（嚴(yán)格按照染色試劑盒說(shuō)明書操作），梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下尋找熒光染色后所拍攝的視野并拍照。每例重復(fù)三次。

6.免疫熒光雙標(biāo)記染色（石蠟切片）

石蠟切片經(jīng)完成脫蠟至水、抗原修復(fù)、H2O2孵育、血清封閉等上述步驟后，每張切片分別滴加50ul的兔抗大鼠NPR-A（1∶25）和小鼠抗人的WT-1（1∶50），置濕盒4 ℃孵育過夜。PBS沖洗（5 min×3），除去PBS，每張切片分別滴加各50ul的山羊抗兔Dy Light 488（激發(fā)綠色熒光）標(biāo)記的熒光二抗（1∶100）和山羊抗鼠Dy Light 549（激發(fā)紅色熒光）標(biāo)記熒光二抗（1∶100），室溫下避光孵育60 min；PBS沖洗（3 min×5），除去PBS，滴加100ul自發(fā)熒光淬滅劑，室溫下孵育1h，PBS沖洗（3 min×3），除去PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察。綠色熒光代表NPR-A陽(yáng)性產(chǎn)物，紅色熒光代表 WT-1陽(yáng)性產(chǎn)物。每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)的皮質(zhì)腎小球高倍視野。結(jié)束后，切片經(jīng)上述步驟處理后，再行PAS染色（PAS染色嚴(yán)格按照染色試劑盒說(shuō)明書操作），梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下尋找熒光染色后所拍攝的視野并拍照。每例重復(fù)三次。

結(jié) 果

1.免疫熒光染色

由圖1所示，冰凍切片組染色可見鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍紊亂，NPR-A陽(yáng)性沉積物呈綠色熒光。NPR-A綠色熒光主要見于皮髓質(zhì)腎小管以及內(nèi)髓集合管，但難以清楚地鑒別出各段腎小管的結(jié)構(gòu)，腎小球也有一定量的表達(dá)。

由圖2所示石蠟切片組染色可見鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，NPR-A陽(yáng)性沉積物呈綠色熒光。NPRA綠色熒光主要見于皮髓質(zhì)腎小管以及內(nèi)髓集合管，切片再染HE后，清楚地顯示NPR-A位于皮質(zhì)的近端小管、外髓的髓袢升支粗段以及內(nèi)髓乳頭管的管腔膜上，其次是直小血管、腎小球、遠(yuǎn)曲小管以及細(xì)段，皮質(zhì)集合管和外髓集合管表達(dá)量相對(duì)較少，多見于閏細(xì)胞的胞漿中。

2.免疫熒光雙標(biāo)記染色

由圖3所示，WT-1特異性地表達(dá)于足細(xì)胞的胞核［5］，足細(xì)胞胞漿均可見NPR-A的綠色熒光，其余腎小球細(xì)胞也可見NPR-A的綠色熒光，表明除了足細(xì)胞外還有其他類型的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)NPR-A。再行PAS染色，并拍攝同一視野后發(fā)現(xiàn)位于系膜基質(zhì)中的系膜細(xì)胞胞漿中也可見NPR-A的綠色熒光，而部分基底膜側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞也可見NPR-A的綠色熒光。部分壁層上皮細(xì)胞也可見少量綠色熒光。由此可見NPR-A在腎小球內(nèi)彌漫性的表達(dá)于足細(xì)胞、系膜細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞。

圖1 腎組織冰凍切片行NPR-A免疫熒光染色（標(biāo)尺：50μm）注：圖a、b、c及d依次代表腎臟皮質(zhì)、外髓外帶、外髓內(nèi)帶以及內(nèi)髓4個(gè)部位（G：腎小球；I MCD：內(nèi)髓集合管）圖2 腎組織石蠟切片先行NPR-A免疫熒光染色以及后續(xù)再行HE染色（標(biāo)尺：50μm）注：圖A、B、C及D依次代表腎臟皮質(zhì)、外髓外帶、外髓內(nèi)帶以及內(nèi)髓4個(gè)部位，圖E、F及G依次代表切片再染HE結(jié)果，分別與圖A、B及C為同一部位，H代表陰性對(duì)照。（PT：近曲小管；DCT：遠(yuǎn)曲小管；CCD：皮質(zhì)集合管；TAL：髓袢升支粗段；OMCD：外髓集合管；VR：直小血管）圖3 腎組織石蠟切片行NPR-A與WT-1免疫熒光雙標(biāo)記染色以及后續(xù)再行PAS染色（標(biāo)尺：20μm）注：圖I：腎小球內(nèi)NPR-A的表達(dá) （綠色）；圖J：腎小球內(nèi) WT-1的表達(dá) （紅色）；圖K：圖I和圖J重疊結(jié)果（→：足細(xì)胞；▲：系膜細(xì)胞）；圖L：后續(xù)再行PAS染色（→：足細(xì)胞；▲：系膜細(xì)胞）。

討 論

在目前的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中，大多選擇冰凍切片而非石蠟切片行免疫熒光染色，究其原因是［6］石蠟切片由于經(jīng)福爾馬林固定而使蛋白質(zhì)交聯(lián)，抗原決定簇被封閉，并且非特異性熒光明顯。而冰凍切片抗原保存更好，且不需要抗原修復(fù)。然而，冰凍切片亦有不足之處，首先，冰凍切片厚度較石蠟切片更厚，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)往往重疊嚴(yán)重，更為不利的是其制作過程中容易產(chǎn)生冰晶［7］，因此大大限制了冰凍切片的廣泛應(yīng)用。石蠟切片較薄，且具有組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、易保存以及無(wú)冰晶困擾等優(yōu)點(diǎn)。

NPR-A即A型利鈉肽受體，通過特異性地結(jié)合ANP和BNP，引起胞內(nèi)第二信使c GMP的升高，進(jìn)而啟動(dòng)一系列胞內(nèi)信號(hào)傳遞過程，發(fā)揮著利尿利鈉、松弛血管、降血壓和抗增值等生物學(xué)效應(yīng)［8］。關(guān)于NPR-A蛋白在大鼠腎組織的具體定位，文獻(xiàn)對(duì)此的報(bào)道仍然充滿了爭(zhēng)議［1，2］。其一，目前的研究關(guān)于NPR-A在各段腎小管以及集合管的定位報(bào)道亦不盡一致；其二，雖然有報(bào)道腎小球內(nèi)存在NPRA蛋白的表達(dá)，但具體何種類型的腎小球細(xì)胞表達(dá)NPR-A仍未完全闡明。明確NPR-A在腎臟組織的分布，對(duì)于闡明腎臟NPR-A的生物學(xué)效應(yīng)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了徹底解決上述關(guān)于NPR-A在腎臟的定位問題，經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)操作，我們探索出一套簡(jiǎn)單有效的解決組織蛋白在腎臟定位的新方法，即利用石蠟切片先行NPR-A免疫熒光染色，再行HE或者PAS染色，并依靠HE或PAS獲得腎臟組織形態(tài)來(lái)判斷NPR-A的表達(dá)部位。

研究選用冰凍切片行NPR-A免疫熒光染色為對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NPR-A主要見于皮髓質(zhì)腎小管、內(nèi)髓集合管以及腎小球（見圖1），但要清楚辨別各段腎小管及集合管的結(jié)構(gòu)十分困難；并且鏡下組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，部分組織由于經(jīng)過高滲蔗糖脫水出現(xiàn)皺縮，導(dǎo)致獲得的形態(tài)欠佳。更為不利的是，已行免疫熒光后的冰凍切片由于組織結(jié)構(gòu)的紊亂，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的HE或PAS染色。在實(shí)驗(yàn)組中，我們利用石蠟切片先行NPR-A免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NPR-A免疫沉積物在腎臟的定位基本類似于冰凍切片染色的結(jié)果，但組織結(jié)構(gòu)比后者清晰，基本無(wú)明顯背景染色。切片再行HE染色后，由HE切片提供的腎臟組織結(jié)構(gòu)信息—即根據(jù)胞漿的嗜酸程度、胞核位置、是否存在刷狀緣以及閏細(xì)胞成功地識(shí)別出近端小管、遠(yuǎn)端小管以及集合管等不同的結(jié)構(gòu)［9］，清楚地顯示：NPR-A免疫陽(yáng)性物主要沉積在皮質(zhì)的近端小管、外髓的髓袢升支粗段以及內(nèi)髓乳頭管的管腔膜，直小血管、腎小球、遠(yuǎn)曲小管和細(xì)段也有一定量的表達(dá)，而皮質(zhì)及外髓集合管NPR-A的表達(dá)顯弱陽(yáng)性，多見于部分閏細(xì)胞的胞漿中（見圖2）。PAS染色（Periodic Acid-Schiff stain）一般用來(lái)顯示糖元和其它多糖物質(zhì)。系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)最重要的細(xì)胞之一，但迄今為止，尚未找到一種標(biāo)記正常系膜細(xì)胞的特異性抗原。正常腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)和基底膜在PAS染色顯陽(yáng)性反應(yīng)，識(shí)別系膜細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。WT-1是一種足細(xì)胞特異性核抗原，在正常的腎臟中僅表達(dá)于成熟的足細(xì)胞胞核上，因此本研究利用WT-1識(shí)別足細(xì)胞，利用PAS染色來(lái)識(shí)別系膜細(xì)胞，即采用石蠟切片先行NPR-A和WT-1免疫熒光雙標(biāo)記染色后，再行PAS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腎小球內(nèi)，NPR-A主要沉積于足細(xì)胞以及系膜細(xì)胞的胞漿中，壁層上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也有少量的表達(dá)（見圖3）。

根據(jù)實(shí)踐，要做好石蠟切片行免疫熒光染色后再行PAS或HE染色，應(yīng)注意下列幾點(diǎn)：①組織切片厚度在1-2μm之間，避免組織細(xì)胞疊加，影響熒光的觀察。②由于多種染色操作步驟繁多、高壓熱修復(fù)以及再行后續(xù)的PAS或HE染色，務(wù)必要求使用涂過防脫片劑的載玻片，以防脫片。③由于石蠟包埋所致的部分抗原決定簇被封閉，選擇石蠟切片進(jìn)行免疫熒光時(shí)，選擇一抗的濃度往往要高于采用冰凍切片時(shí)的一抗?jié)舛?。④后續(xù)再行PAS或HE染色前，利用在酸性環(huán)境能使抗體從抗原抗體復(fù)合物中解離出來(lái)的原理［10］，將熒光染色后的石蠟切片用4.5-5.0的50%的乙醇浸泡10 min，使抗體蛋白與組織成分解離而不損害切片組織。⑤石蠟切片經(jīng)過甲醛固定石蠟包埋等過程，容易產(chǎn)生自發(fā)性熒光［11］，這也是大多研究者不推薦石蠟切片行免疫熒光染色的重要的原因之一，為解決這個(gè)棘手的難題，可在甘油封片前增加一個(gè)步驟，即選用自發(fā)熒光猝滅劑孵育1小時(shí)，可以大大降低石蠟切片的非特異性熒光。

總結(jié)此研究方法的優(yōu)點(diǎn)：①石蠟切片厚度較?。ū緦?shí)驗(yàn)采用的石蠟切片厚度為1～2u m），可以避免細(xì)胞重疊，而冰凍切片厚度較厚，要拍出好的效果多需要激光共聚焦顯微鏡，本研究?jī)H用普通的熒光顯微鏡就可以達(dá)到良好的效果，易于掌握、使用方便。②目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于某種物質(zhì)在腎組織的定位研究，大多采用組織抗原特異性抗體進(jìn)行免疫熒光多重染色從而識(shí)別出多種腎小球細(xì)胞或腎小管細(xì)胞，不足之處在于實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴。本研究利用石蠟切片先行免疫熒光染色后再行PAS或HE染色，在不用或少用特異性抗體的情況下，成功地解決了NPR-A蛋白在大鼠腎組織表達(dá)的分布位置及細(xì)胞定位的難題。

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The localization of NPR-A protein in rat kidney tissues was deter mined by using paraffin section with i mmunofluorescence then following PAS or HE staining

Lin Zhang1，2，Hong Huashan1＊，Lin Junhua1，Lin Xiaohong1，F(xiàn)ang Meiqin1
（1Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou，350001；2Depart ment of Car diology，Gerontological Hospital of Fujian，Northern hospital of Fujian Provincial Hospital，350003，China）

Objective To introduce a new method to deter mine the localization of NPR-A proteins in rat kidney tissues.Met hods I mmunofl uorescence staining was used to detect NPR-A expression in paraffin sections of rat kidney tissues wit h，t hen f ollowed a PAS or HE staining.Results The localization of NPRA proteins was shown predo minantly in the cortex proxi mal tubular，medullary thick ascending li mb and inner medullary collecting ducts.A certain quantity of NPR-A proteins was expressed in vasa recta，glomerul us，distal convoluted tubule and in medullary thin li mbs.But little expression was f ound in the cortex medullary collecting ducts and outer medullary collecting ducts.Conclusion In the condition of without or less using specific antibodies，t he method of paraffin sections wit h i mmunofl uorescence and t hen PAS or HE staining is successf ul in solving the problems of both distribution and cell localization of NPR-A protein expression in t he kidney tissues.

NPR-A；I mmunofl uorescence staining；Kidney；Localization

R322.61

A

10.3870／zgzzhx.2012.03.015

2012-01-10

2012-04-01

閩都中小銀行教育發(fā)展基金會(huì)資助課題

林璋，男（1984年），漢族，住院醫(yī)師。

＊通訊作者（To who m correspondence should be addressed）