孫麗娜 周東方 周俊英

腺苷蛋氨酸預防酒精性肝病及其作用機制探討

孫麗娜 周東方 周俊英＊

（河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科，石家莊050051）

目的 探討腺苷蛋氨酸（SA M）防治大鼠酒精性肝病的作用機制。方法 健康雄性wistar大鼠30只，隨機分為對照組、模型組和SAM干預組。模型組大鼠采用逐漸增加濃度（30%-60%）和劑量（5-9g·kg-1·d-1）的方法酒精灌胃16周，干預組增加SA M（100 mg／kg）灌胃，其它同模型組。16周末隨機處死動物，檢測血清總同型半胱氨酸（t Hcy）的濃度和肝組織胱硫醚β合成酶（CBS）的活性；分別采用免疫組化方法和RT-PCR法檢測肝組織中GRP-78、calpain 2及其caspase-12的表達；采用TUNEL染色法檢測肝細胞凋亡。結果 模型組大鼠16周末出現(xiàn)肝細胞彌漫小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。SA M組病理改變較模型組明顯減輕。SA M組血清t Hcy的濃度（7.00±0.79）較模型組（9.85±0.12）明顯降低，而CBS的活性（511.60±57.44）較模型組（390.45±31.17）升高，F(xiàn)值分別為147.28和41.14，P 值均＜0.01；免疫組化和RT-PCR結果顯示SAM組GRP-78、Calpain 2、caspase-12的表達較模型組減弱；SAM組的肝細胞凋亡指數(shù)（31.24±2.65）較模型組（65.71±9.78）降低，F(xiàn) 值為301.79，P＜0.01。結論 在大鼠酒精性肝病中，腺苷蛋氨酸通過提高胱硫醚β合成酶活性，改善內質網(wǎng)應激，減少肝細胞凋亡，減輕肝臟損傷。

肝??；酒精性；內質網(wǎng)應激；S-腺苷甲硫氨酸；細胞凋亡；

在酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）發(fā)病過程中，由于胱硫醚β合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）的活性降低導致的高同型半胱氨酸血癥（hyperho mocysteinemia，Hhcy）可誘發(fā)內質網(wǎng)應激（ehdoplas mic reticulu m stress，ERS）［1，2］，過強的ERS通過需鈣蛋白酶2（calpain 2）和caspase-12信號途徑的激活可啟動細胞凋亡程序［3-5］。腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SA M）是蛋氨酸循環(huán)的重要調節(jié)物，可激活胱硫醚β合成酶（cystat hionine betasynthase，CBS），使其活性增強［6］。本研究擬用酒精灌胃的方法建立大鼠ALD模型，并用SA M進行干預，通過對肝組織病理變化的觀察，對總同型半胱氨酸（total ho mocysteine，t Hcy）和 CBS的檢測，并檢測ERS相關指標和肝細胞凋亡，來探討SA M通過抑制ERS預防和治療ALD的作用機制。

材料和方法

1.材料

雄性wistar大鼠30只，體重200±20g，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供（合格證號708020）。酒精為市售62°衡水老白干。葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP-78）、procaspase-12兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術公司；calpain 2兔多克隆抗體購自武漢博士德生物技術公司；RT-PCR試劑盒購自 Ta Ka Ra公司；GRP78、calpain 2、caspase-12、GAPDH 引物自行設計由上海捷瑞生物工程公司合成；同型半胱氨酸檢測試劑盒購自美國雅培制藥公司；TUNEL試劑盒購自美國pr o mega公司。

2.動物模型的建立

大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組和SA M干預組，每組10只。模型組和SA M干預組大鼠每日上午9時用酒精灌胃（30%-60%，5-9g·kg-1·d-1）；SAM 干預組下午4時用SA M 灌胃，劑量為100 mg／kg。于16周末禁食12h后隨機處死大鼠（模型組大鼠在造模過程中死亡2只），留取血清及肝組織標本［7-8］。

3.t Hcy和CBS的測定

（1）采用美國雅培制藥公司的AXSY M型化學發(fā)光分析儀和同型半胱氨酸檢測試劑盒檢測血清t Hcy的濃度，嚴格按說明操作。（2）用比色法測定肝勻漿CBS的活性，酶活性單位的定義為在37℃1h催化1μmol胱硫醚生成所需的酶量為1個單位。

4.病理學檢查

肝組織蠟塊切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

5.免疫組化法檢測肝組織 GRP-78、calpain 2、caspase-12前體蛋白（pr ocaspase-12）的表達

采用免疫組化PV法測定：肝組織切片常規(guī)脫蠟至水，進行抗原修復；3%H2O2室溫下孵育15 min，分別滴加 GRP-78、calpain 2和procaspase-12兔多克隆抗體，4℃過夜，陰性染色用PBS代替一抗；滴加二步法免疫組化檢測試劑，37℃孵育40 min；DAB顯色；水洗，蘇木精復染3 min，0.1%鹽酸分化，氨水返藍，鏡下觀察，以胞漿內出現(xiàn)棕色顆粒判定為陽性。

6. RT-PCR 法 檢 測 GRP-78、calpain 2、caspase-12 mRNA 的表達

取總RNA 2μg（1μg／μl），加入 RT反應體系管中合成c DNA，以c DNA為模板進行PCR擴增。取每個標本的擴增產(chǎn)物6μl于1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，應用法國VL公司BIOPROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，以目的條帶／GAPDH條帶的吸光度比值為相對表達量。（引物序列及反應條件見表1）。

表1 RT-PCR引物序列及反應條件Table 1 the pri mers sequence and reactive conditions

7.TUNEL法檢測肝細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）

肝組織蠟塊切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫10 min，10μg／ml蛋白酶 K 室溫通透10 min，加TUNEL粉室溫1.5h，加鏈酶卵白素標記的HRP室溫反應30 min，DAB顯色，蘇木素襯染，鏡下觀察。細胞核呈棕色為陽性細胞。觀察5個隨機高倍視野，計數(shù)至少500個細胞，計算凋亡指數(shù)（AI＝陽性細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%）。

8.統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設計的方差分析，方差齊時用S-N-K法，方差不齊時用Tamhane’s進行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。相關性分析用Pearson直線相關分析法。

結 果

1.肝組織病理變化

光鏡下，HE染色顯示對照組肝組織小葉結構正常；模型組大鼠肝細胞呈彌漫性小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成，可見多量凋亡小體和壞死灶。SA M組大鼠肝組織小葉結構完整，可見少量肝細胞小泡性脂肪變性，凋亡小體和壞死灶較少，與模型組比較，病理改變明顯減輕，見圖1。

2.t Hcy和CBS的測定結果

模型組大鼠血清t Hcy的水平較對照組明顯升高，SA M組大鼠t Hcy的水平介于模型組和對照組之間，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝66.12，P＜0.01）。模型組肝組織勻漿CBS的活性較對照組明顯降低，SA M組CBS的活性較模型組增高，差異有統(tǒng)計學意義（F＝41.14，P＜0.01）。t Hcy和 CBS二者呈負相關，（r＝-0.805，P＜0.01）（表2）。

表2 大鼠t Hcy和CBS測定結果（ˉx±s）Table 2 The ser u m level of t Hcy and CBS in the rats（ˉx±s）

3.免疫組化法檢測大鼠肝組織GRP-78、calpain 2和pr ocaspase-12的表達

對照組大鼠肝組織內僅有少量GRP-78和calpain 2蛋白表達，模型組二者表達明顯增加，主要表達于肝細胞胞漿內。光鏡下對照組大鼠肝組織有較多procaspase-12的表達，模型組其表達明顯減少，主要表達于肝細胞胞漿內。SA M組大鼠肝組織GRP-78和cal pain 2蛋白的表達較模型組減少（圖2，圖3），procaspase-12的表達較模型組增多（圖4）。

4.RT-PCR法檢測 GRP-78、calpain 2、caspase-12 mRNA的表達量：對照組大鼠肝組織中僅表達少量的GRP-78、calpain 2、caspase-12 mRNA，模型組上述指標的表達明顯增加，SA M組肝組織中GRP-78、cal pain 2、caspase-12 mRNA 的表達較模型組減少。各組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)值分別為385.93、397.66、256.49，P 值均＜0.01（圖5）。肝組織中GRP-78 mRNA的表達與血清t Hcy的濃度呈正相關，r＝0.909，P＜0.01。

5.TUNEL染色法檢測肝細胞凋亡指數(shù)：在對照組僅有極少量肝細胞凋亡（2.17±1.06），模型組肝細胞凋亡指數(shù)增加（65.71±9.78），SA M 組肝細胞凋亡指數(shù)較模型組降低（31.24±2.65），各組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝301.79，P＜0.01）（圖6）。肝細胞凋亡指數(shù)與cal pain 2和caspase-12 mRNA表達呈正相關，r分別為0.937和0.863，P值均小于0.01。

討 論

ALD是因長期過量飲酒引起的中毒性肝臟疾病，其發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明［9］，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ERS及其介導的肝細胞凋亡在其中發(fā)揮重要作用。ERS是指由于各種原因導致細胞內質網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，錯誤折疊或未折疊的蛋白質在內質網(wǎng)腔內聚集的一種亞細胞器的病理狀態(tài)，使錯誤的蛋白質恢復正確構象并能夠進一步加工的必需步驟。ERS是機體的一種自我保護機制，但反應過強或持續(xù)的時間過長，則會導致細胞凋亡，加重肝臟損傷。

在ALD中，ERS可由高同型半胱氨酸血癥和氧化應激等作用誘導［10］。在人和動物實驗中，發(fā)現(xiàn)長期乙醇攝入可導致血漿同型半胱氨酸濃度增高，導致Hhcy。Hhcy可使內質網(wǎng)內錯誤折疊或未折疊的蛋白增多，從而誘發(fā)ERS［11］。CBS為 Hcy代謝過程中的限速酶，Hcy可在CBS的催化下，以維生素B6為輔助因子，轉硫化生成胱硫醚，再生成半胱氨酸和α-丁酮酸。CBS功能障礙是導致Hhcy最常見的原因。腺苷蛋氨酸為蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，它在體內是由蛋氨酸和ATP在蛋氨酸腺苷轉移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）的催化下作用生成，是谷胱甘肽的前體物質。在大量的長期乙醇攝入的動物實驗和酒精性肝炎病人中，發(fā)現(xiàn)肝組織中SA M的含量減少，主要原因為乙醇暴露使MAT的活性降低，從而使SA M的生成減少，另外SA M作為谷胱甘肽的前體物質被乙醇代謝引起的氧化應激大量消耗。CBS的分子結構中含有SA M的結合位點，SA M是CBS酶活性發(fā)揮的重要調節(jié)物，它可激活CBS，使其活性增強2-5倍，所以在酒精性肝病中，SA M含量的減少，也是CBS活性降低的重要原因。

GRP-78是內質網(wǎng)內駐留最多的分子伴侶，應激發(fā)生時，內質網(wǎng)內未折疊蛋白增多，GRP-78可與未折疊蛋白結合并幫助其正確折疊，從而反應性增多，因此，GRP78被認為是ERS的標志性分子。本研究顯示，正常對照組大鼠肝組織中，GRP-78僅有少量表達，模型組大鼠GRP-78蛋白和mRNA表達明顯增加，表明在大鼠酒精性肝病模型中存在ERS。ERS介導的凋亡是近些年提出的一種新的凋亡途徑，cal pain和caspase-12是此過程中的關鍵酶。calpain存在于細胞質中，主要包括calpain 1和cal pain 2，cal pain 1通常是在生理條件下發(fā)揮作用，而calpain 2則在病理情況（細胞內鈣超載）下才能被激活。有研究表明，當ERS時，鈣離子從內質網(wǎng)腔釋放到胞漿中，可與calpain 2大小亞基上的EF手臂即鈣離子結合位點結合，從而激活cal pain 2［12］。caspase-12位于內質網(wǎng)膜的胞漿側，以酶原（procaspase-12）的形式存在。ERS時，calpain 2活化后轉位于內質網(wǎng)膜上切割pr ocaspase-12，使其成為有活性的片段，即活化的caspase-12。caspase-12活化后，引發(fā)caspase級聯(lián)反應，導致染色體DNA斷裂，最終產(chǎn)生細胞凋亡。

本研究顯示，在正常對照組大鼠肝組織中，calpain 2僅有少量表達，而procaspase-12的表達較高，模型組大鼠calpain 2的表達逐漸增多，pr ocaspase-12的表達逐漸減少，表明ERS發(fā)生時，calpain 2被激活，繼而激活caspase-12，使大量無活性的酶原降解為有活性的酶，從而發(fā)揮促凋亡的作用。而腺苷蛋氨酸干預組肝組織病理損害明顯減輕，血清t Hcy的濃度降低、CBS的活性升高、GRP78表達明顯減少、肝組織凋亡指數(shù)降低，calpain 2的表達和caspase-12 mRNA的表達較少，表明SAM可通過激活CBS的活性，減輕Hhcy，進而通過抑制ERS誘發(fā)的肝細胞凋亡的作用來改善酒精所致的肝損傷。

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圖 版 說 明

圖1 大鼠肝組織HE染色，×200

圖1 A.對照組大鼠肝組織HE染色，×200；圖1B.SAM 組大鼠肝組織HE染色，×200圖1C.模型組大鼠肝組織HE染色，×200

圖2 大鼠肝組織GRP-78蛋白表達DAB，×400

圖2 A.對照組大鼠肝組織GRP-78免疫組化，×400；圖2B.SAM 組大鼠肝組織GRP-78免疫組化，×400；圖2C.模

型組大鼠肝組織GRP-78免疫組化，×400

圖3 各組大鼠肝組織Calpain 2蛋白表達DAB，×400

圖3 A.對照組大鼠肝組織Calpain 2免疫組化，×400；圖3B.SA M 組大鼠肝組織Calpain 2免疫組化，×400；圖3C.模型組大鼠肝組織Calpain 2免疫組化，×400

圖4 各組大鼠肝組織pr ocaspase-12蛋白表達DAB×400

圖4 A.對照組大鼠肝組織procaspase-12免疫組化，×400；

圖4B.SA M組大鼠肝組織pr ocaspase-12免疫組化，×400；

圖4C.模型組大鼠肝組織procaspase-12免疫組化，×400

圖5 RT-PCR檢測各組大鼠肝組織 GRP-78、calpain 2和caspase-12 mRNA的表達變化

圖6 大鼠肝組織肝細胞凋亡TUNEL法，×400

圖6 A.對照組大鼠肝組織肝細胞凋亡TUNEL法，×400；

圖6B.SMA組大鼠肝組織肝細胞凋亡TUNEL法，×400；

圖6C.模型組大鼠肝組織肝細胞凋亡TUNEL法，×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 HE staining of rats hepatic tissue.×200

Fig.1 A.HE staining of rats hepatic tissue in nor mal control group，×200；Fig.1B.HE staining of rats hepatic tissue in SAM group，×200；

Fig.1 C.HE staining of rats hepatic tissue in model group，×200

Fig 2.The expression of GRP-78 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue DAB，×400

Fig.2 A.The expression of GRP-78 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue of nor mal control gr oup，×400.Fig.2B.The expression of GRP-78 by i mmunohistoche mical staining in rats hepatic tissue of SA M group，×400.Fig.2C.The expression of GRP-78 by i mmunohist oche mical staining in rats hepatic tissue of model gr oup，×400

Fig 3.The expression of Calpain 2 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue DAB，×400

Fig.3 A.The expression of Calpain 2 by i mmunohistoche mical staining in rats hepatic tissue of nor mal control gr oup，×400；Fig.3B.The expression of Calpain 2 by i mmunohist ochemical staining in rats hepatic tissue of SA M group，×400；Fig.3C.The expression of Calpain 2 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue of model group，×400

Fig.4 The expression of pr ocaspase-12 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue DAB，×400

Fig.4 A.The expression of procaspase-12 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue of nor mal control group，×400；Fig.4B.The expression of procaspase-12 by i mmunohistochemical staining in rats hepatic tissue of SAM group，×400；Fig.4C.The expression of procaspase-12 by i mmunohistochemical staining

Fig.5 The expression of GRP-78，calpain 2 and caspase-12 mRNA in hepatic tissue by RT-PCR

Fig.6 The rats hepatic cells apoptosis by TUNEL staining in rats hepatic tissue，×400

Fig.6 A.The rats hepatic cells apoptosis by TUNEL staining in normal control group，×400；Fig.6B.The rats hepatic cells apoptosis by TUNEL staining in SA M group，×400；Fig.6C.The rats hepatic cells apoptosis by TUNEL staining in model group，×400

Machenism of S-adenosyl methionine in the treat ment of alcoholic liver disease

Sun Lina，Zhou Dongfang，Zhou Junying＊
（Depart ment of Infectious Disease，The Thir d Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

Objective To investigate t he mechanis m of S-adenosyl met hionine（SA M）inhibiting endoplas mic reticul u m （ER）stress and preventing hepatocyte apoptosis in rat alcoholic liver disease.Met hods Thirty male Wistar rats were rando mly divided into 3 groups：control group，model group and SA M-treated gr oup（SA M gr oup）.The model gr oup was treated wit h intragastric alcohol of gradually increasing concentration and dose（30%-60%，5-9g／kg／d）f or 16 weeks.The SA M group was treated with alcohol pl us SA M（100 mg／kg）.After the ani mals were sacrificed rando mly at week 16，the ser u m level of total ho mocysteine（t Hcy）and t he activity of cystat hionine beta-synt hase（CBS）in liver tissue were exa mined.The expressions of GRP-78，calpain 2，caspase-12 and procaspase-12 were analyzed by reverse transcription-pol y merase chain reaction（RT-PCR）and i mmunohistoche mistry respectively.Hepatocyte apoptosis was deter mined by Td T-mediated d UTP nick end labeling（TUNEL）.Results At t he 16thweek，diff use microvesicular adipose degeneration，fibrosis in liver sinus and fibrosis septa in portal area were observed in hepatic tissue of t he model group.SA M suppressed t he develop ment of alcohol-induced liver injur y.The ser u m level of t Hcy in the SA M group was significantly lower than that in the model group （P＜0.01），and t he activity of CBS was increased in t he SA M gr oup co mpared wit h t hat in t he model gr oup （P＜0.01）.The expression of GRP-78，Cal pain 2 and caspase-12 decreased in t he SA M gr oup.In addition，t he hepatocyte apoptosis index（AI）in the SA M group was lower than in the model group.Conclusion SA M can prevent hepatocyte apoptosis and i mpr ove liver injury by increasing t he activity of CBS and inhibiting endoplas mic reticulu m stress in rats with alcoholic liver disease.

Alcoholic liver disease；ER stress；S-adenosyl methionine；Apoptosis

R322.47

A

10.3870／zgzzhx.2012.03.004

2011-11-26

2012-03-16

河北省醫(yī)學科學研究重點課題（20100101）

孫麗娜，女（1977年），漢族，碩士研究生，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To who m correspondence should be addressed）