王堅苗 劉先勝 徐永健

白介素-18在被動吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾病大鼠中的表達

王堅苗 劉先勝 徐永健＊

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，武漢430030）

目的 研究白介素-18（Interleukin-18，IL-18）在被動吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pul monary disease，COPD）大鼠中的表達變化。方法 將20只大鼠隨機分為2組，即正常對照組和COPD模型組。應用單純被動吸煙法建立大鼠COPD模型，香煙煙霧暴露時間為6個月。利用酶聯免疫吸附法測定2組大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（bronchoal veolar lavage fluid，BALF）中的IL-18濃度，用實時定量 RT-PCR法測定 BALF中IL-18 mRNA 的表達水平，用HE染色法觀察肺組織形態(tài)學改變，用免疫組織化學染色法檢測IL-18在肺組織中的表達。結果 1.COPD模型組血清和BALF中的IL-18濃度較正常對照組顯著增加（P＜0.01）；2.COPD模型組BALF中IL-18 mRNA的表達水平較正常對照組顯著增高（P＜0.01）；3.COPD模型組肺組織中IL-18的表達較正常對照組顯著增加（P＜0.01）。結論 被動吸煙誘導的COPD大鼠外周血和肺部均高表達IL-18，提示IL-18在吸煙所致的COPD發(fā)病機制中可能起重要作用。

白介素-18；被動吸煙；慢性阻塞性肺疾病

慢 性 阻 塞 性 肺 疾 病 （chronic obstr uctive pulmonar y disease，COPD）是以不完全可逆的氣流受限為特征的一種慢性疾病狀態(tài)，氣流受限往往呈進行性加重，且主要與肺部對有害顆粒或氣體的異常炎癥反應有關。在全世界范圍內，無論是發(fā)病率還是死亡率仍然在逐年增加。中國在未來的半個世紀將會每年有150萬人死于COPD，預計到2020年，COPD將成為全球第3位死亡原因［1］。吸煙被認為是COPD的最主要危險因素，由于至今仍然沒有明確有效的藥物可以阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，戒煙被認為是預防和控制疾病的最重要方法，然而停止吸煙后，肺部的炎癥反應卻并沒有中止。到目前為止，這種異常的炎癥反應在COPD發(fā)生發(fā)展中的機制仍然不是十分清楚。因此，進一步深入研究COPD中的炎癥反應顯得非常重要。

大量的炎癥細胞浸潤是COPD的重要病理學特征，這些炎癥細胞可以釋放出多種細胞因子和炎癥介質，尤其是Th1型細胞因子，是導致疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因，香煙煙霧刺激可能是其主要誘因。白介素-18（interleukin-18，IL-18）是一種重要的促炎癥因子，屬于IL-1細胞因子家族，它可以促進T淋巴細胞的增殖并誘導調節(jié)Th1細胞的分化成熟和促進Th1細胞為主的細胞免疫反應。已有研究發(fā)現它與多種人類慢性疾病有關如關節(jié)炎、多發(fā)性硬化和炎癥性腸病等［2］。但IL-18在肺部疾病尤其是在COPD領域的研究還不多，I maoka等研究發(fā)現COPD患者的肺組織及血清中IL-18的表達顯著高于健康對照組，并且血清中的IL-18濃度與肺功能呈負相關［3］，Rovina等還發(fā)現COPD患者誘導痰中的IL-18濃度也顯著高于健康對照組，并且與肺功能呈負相關［4］。這些研究提示IL-18有可能參與了COPD的發(fā)生發(fā)展過程中。

然而，單純吸煙是否可以直接誘導體內IL-18的高表達尚不是很清楚。目前，國內暫無相關研究報道，國外有一篇文獻研究了被動吸煙小鼠支氣管肺泡灌洗液（br onchoal veolar lavage fl uid，BALF）和肺組織中的IL-18表達情況［5］。但是，國內包括本科室最為常用且比較成熟的COPD動物模型主要是大鼠模型，另外，上述文獻并沒有研究IL-18在血清中的表達情況。因此，本實驗主要是研究被動吸煙所誘導的COPD大鼠血清、BALF以及肺組織中的IL-18表達變化情況，從而為進一步研究IL-18在COPD發(fā)病機制中的作用建立動物模型基礎。

材料和方法

1.建立COPD大鼠模型

清潔級雄性SD大鼠20只，體重180-220g（購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心）。采用隨機數字法將其分為2組，即COPD模型組和正常對照組，每組10只。正常對照組大鼠呼吸新鮮空氣，而COPD模型組大鼠則給予被動吸煙（紅金龍牌香煙），每天1次，每次燃燒10支香煙，每支10 min，前后2支間隔5 min，每周6天，共6個月。正常對照組有1只大鼠在第92 d死亡，COPD模型組有2只大鼠分別在第35 d和51 d死亡。6個月后，對所有剩余大鼠進行相關檢測。

2.標本采集

用10%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉并固定，經下腔靜脈采血，靜置后低溫離心取得血清，將其保存于-70℃冰箱待測。立即暴露氣管和雙肺，在氣管上段作一橫切口，并夾閉左側主支氣管，用注射器經氣管切口向右肺緩慢注入4 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）并回收（回收率85%-90%），重復3次，將第1次的BALF離心，取其上清并保存于-70℃冰箱待測，取其沉淀與后2次BALF混勻并離心，棄上清，再將沉淀用1 ml PBS洗滌3次后轉移至1.5 ml EP管中，用于RT-PCR檢測。取下左肺，將4%多聚甲醛溶液3 ml經左主支氣管注入左肺，并將其浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h用于組織學檢測。

3.血清和BALF中的IL-18濃度測定

應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定2組大鼠血清和 BALF 中 的IL-18蛋 白 濃 度，大 鼠IL-18 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，按試劑盒說明書進行檢測。

4.BALF中IL-18 mRNA表達水平測定

應用實時熒光定量RT-PCR檢測BALF中IL-18 mRNA的表達水平。總RNA按照Invitrogen公司試劑盒說明書進行抽提與純化，按照Takara公司逆轉錄試劑盒說明書合成c DNA。實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒（SYBR Pre mix Ex Taq）購自Takara公司，IL-18的上下游引物序列分別為5＇-GACTGGCTGTGACCCTATCTGTGA-3＇和 5＇-TTGTGTCCTGGCACACGTTTC-3＇，內 參 GAPDH的上下游引物序列分別為5＇-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3＇ 和 5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3＇，以上引物均由 Takara公司合成。在實時定量 PCR 儀 （ABI Pris m 7900 HT）上按照Takara公司試劑盒說明書進行檢測，PCR步驟：預變性 （95℃，30s）；40 個 PCR 循環(huán)（95℃，5s；60℃，30s）；融解。確認擴增曲線和融解曲線后，根據測得的CT值進行相對定量分析。

5.肺組織形態(tài)學觀察及IL-18的表達檢測

取大鼠肺組織標本進行石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色后，觀察各組肺組織形態(tài)學變化。用免疫組織化學染色法（SP法）檢測IL-18在肺組織中的表達，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用小鼠抗IL-18單克隆抗體作為一抗（Santa Cr uz公司），稀釋度為1∶200，用DAB進行顯色，蘇木素復染細胞核及中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。胞漿呈棕黃或深棕黃染色的為陽性細胞，在顯微鏡下以相同的外部條件對每個切片隨機選取上、下、左、右及中5個視野進行圖像攝取，應用H MIAS-2000真彩病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定其平均光密度值，用于表示肺組織中IL-18表達的相對量。

6.統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（ˉx±s）表示，兩組比較應用t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

結 果

1.血清和BALF中的IL-18濃度

COPD模型組和正常對照組大鼠血清和BALF中的IL-18濃度測定結果見表1。COPD模型組血清和BALF中的IL-18濃度顯著高于正常對照組（P＜0.01）。

表1 2組大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中的IL-18表達水平比較Table 1 The co mparison of the IL-18 levels in seru m and bronchoalveolar lavage fl uid of t wo groups.

2.BALF中IL-18 mRNA表達

實時定量RT-PCR檢測結果見表2。COPD模型組IL-18和GAPDH擴增的平均CT值分別為16.41和17.53，而正常對照組IL-18和GAPDH 擴增的平均CT值分別為19.80和18.44。COPD模型組和正常對照組相比，ΔΔCT＝-2.47，2-（-2.47）＝5.54，即COPD模型組BALF中IL-18 mRNA表達水平是正常對照組的5.54倍。

表2 2組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-18和GAPDH mRNA的表達（平均CT值）Table 2 The expression of the IL-18 and GAPDH mRNA in br onchoalveolar lavage fl uid of t wo groups（average CT val ues）.

3.肺組織形態(tài)學改變及IL-18的表達

正常對照組中除極個別大鼠可見輕微的炎癥改變外，其余均無明顯異常，支氣管管壁結構清楚，粘膜完整，管腔無狹窄及滲出，管壁及周圍無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡結構完整，大小較一致，肺泡壁正常，肺泡腔內無滲出。COPD模型組大鼠支氣管平滑肌明顯增厚，氣道上皮杯狀細胞化生，管腔狹窄并可見滲出，管壁及周圍出現大量的炎癥細胞浸潤，肺泡壁斷裂，肺泡腔擴大并可見較多炎癥細胞。見圖1和圖2，提示大鼠被動吸煙6個月后肺組織表現出典型的COPD病理學改變。免疫組織化學染色顯示IL-18主要表達于淋巴細胞和巨噬細胞的胞漿中，氣道上皮細胞、血管內皮細胞及肺泡上皮細胞也可見少量表達，見圖3和圖4。對圖像進行平均光密度測定的結果見表3，分析結果顯示COPD模型組大鼠肺組織中的IL-18表達顯著高于正常對照組（P＜0.01）。

表3 2組大鼠肺組織中的IL-18表達比較（平均光密度值）Table 3 The comparison of the average optical density values of IL-18 in rat lung tissues of t wo groups.

討 論

肺部對于有害氣體或顆粒的異常炎癥反應是COPD發(fā)生發(fā)展的主要原因之一，各種細胞（包括炎癥細胞和實質細胞等）和細胞因子共同參與了這種異常炎癥反應，并且相互之間構成了一個極其復雜的炎癥網絡。吸煙是目前公認的COPD主要危險因素，長期的香煙煙霧暴露可以導致肺部大量炎癥細胞浸潤，這些炎癥細胞可以釋放出各種細胞因子，通過各種復雜的機制最終促使COPD的形成。本研究中，大鼠被動吸煙6個月后，肺組織形態(tài)學觀察證實單純吸煙即可誘導出典型的COPD病理學改變。

到目前為止，盡管國內外對此已經進行了大量的臨床與基礎研究，但是COPD的炎癥機制仍然不是十分清楚。在細胞因子研究方面，不斷有新的細胞因子被發(fā)現可能參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。IL-18是一種促炎癥細胞因子，它是通過與IL-18受體結合而發(fā)揮其作用的，IL-18受體由配體結合功能α亞單位和信號轉導功能β亞單位兩部分組成［6，7］。起初是因為其具有誘導淋巴細胞產生γ-干擾素的功能，因此將其稱為γ-干擾素誘導因子，但后來發(fā)現它還具有其他更多的功能，最主要的功能是能誘導調節(jié)Th1細胞的分化成熟和促進Th1細胞為主的細胞免疫反應。

近年來的臨床研究發(fā)現，IL-18在COPD患者的肺組織中存在高表達，并主要表達于CD8陽性T淋巴細胞和肺泡巨噬細胞［3］。在本研究中，我們同樣發(fā)現COPD模型組大鼠的肺組織中IL-18表達顯著高于正常對照組，并且陽性表達的細胞主要是淋巴細胞和肺泡巨噬細胞。還有研究發(fā)現COPD患者的誘導痰中IL-18的表達也是增加的［4］，而在本實驗中，COPD模型組大鼠BALF中的IL-18 mRNA表達和IL-18濃度也是顯著高于正常對照組的。這些結果提示IL-18可能參與了吸煙所致COPD發(fā)病的炎癥過程。且已有基礎研究發(fā)現過表達IL-18的轉基因小鼠肺組織內的IL-18表達增加并最終形成了嚴重的肺氣腫［8］，提示IL-18本身就可以誘導COPD的形成。

除了肺部的表現外，COPD也往往存在著顯著的全身效應或者稱為系統(tǒng)效應，有學者用“溢出”理論來解釋COPD的全身效應，認為局部炎癥反應過重時即可出現全身的炎癥反應，其中的一個表現是外周血中的某些炎癥介質濃度異常升高。研究發(fā)現COPD患者血清中IL-18的濃度顯著高于健康對照組［3］。而在本研究中，我們也同樣發(fā)現COPD模型組大鼠外周血中的IL-18濃度較正常對照組顯著升高。另有研究也發(fā)現COPD患者血清中和骨骼肌中IL-18 mRNA的表達較正常對照組均顯著增加，認為IL-18可能參與了COPD惡病質的形成［9］。

在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中，根據IL-18的功能推測其可能是通過誘導淋巴細胞產生γ-干擾素、促進炎癥細胞聚集、調節(jié)Th1細胞的分化成熟和促進Th1細胞為主的細胞免疫反應而發(fā)揮作用。但IL-18如何具體參與這些過程以及是否與COPD的全身效應直接相關仍然需要進一步的研究證實。本研究提示IL-18在吸煙所致的COPD發(fā)病機制中可能起重要作用，并為進一步研究其在COPD發(fā)病機制中的作用建立動物模型基礎。

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圖 版 說 明

圖1 正常對照組（HE染色 ×100）

圖2 COPD模型組（HE染色 ×100）

圖3 正常對照組（免疫組化SP法 ×400）

圖4 COPD模型組（免疫組化SP法 ×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Lung tissue of control group.HE staining×100

Fig.2 Lung tissue of COPD gr oup.HE staining×100

Fig.3 The expression of IL-18 in lung tissue of control group.SP method×400

Fig.4 The expression of IL-18 in lung tissue of COPD group.SP method×400

Expression of interleukin-18 in rats with induced by passive smoking chronic obstructive pul monary disease

Wang Jian miao，Liu Xiansheng，Xu Yongjian＊
（Depart ment of Respir ator y and Critical Care Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective To study the expression of interleukin-18（IL-18）in rats with passive s moking induced chronic obstr uctive pul monar y disease（COPD）.Met hods Twenty rats were rando mly divided into a nor mal contr ol gr oup and a COPD model gr oup.Rat COPD model was established by passive s moking f or 6 months.The levels of IL-18 in seru m and bronchoalveolar lavage fluid （BALF）were measured by ELISA.The levels of IL-18 mRNA in BALF were deter mined by real ti me RT-PCR.The l ung tissue pathology was observed with HE staining.Immunohistochemical staining was used to investigate the expression of IL-18 in pul monar y tissues.Results 1.The levels of IL-18 in ser u m and BALF in t he COPD gr oup were significantl y higher t han t hose in t he contr ol gr oup （P＜0.01）.2.The levels of IL-18 mRNA in BALF were significantly higher in the COPD group than in the control group（P＜0.01）.3.The expressions of IL-18 in pul monar y tissues were significantl y higher in t he COPD gr oup t han in t he contr ol gr oup（P＜0.01）.Conclusion The expression of IL-18 significantly increased in peripheral blood and lung of rats wit h passive s moking induced COPD.Theses results suggest t hat IL-18 may be i mplicated in t he pat hogenesis of COPD caused by s moking.

Interleukin-18；Chronic obstr uctive pul monary disease；Passive s moking

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.03.001

2012-01-13

2012-04-01

2010年度衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項（201002008）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAI05B01）〔作者簡介〕王堅苗，男（1978年），漢族，博士研究生。

＊通訊作者（To who m correspondence should be addressed）