周兆華 王慶豐 顧慶華

常熟市疾病預(yù)防控制中心，江蘇常熟 215500

梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)吸附免疫試驗(yàn)（TP-ELISA）是隨著近年梅毒螺旋體的基因工程抗原研制成功而建立的方法，具有高特異性、高靈敏度高、檢測(cè)費(fèi)用低、適宜大批量檢測(cè)的特點(diǎn)。 2010年12月，我們應(yīng)用TP-ELISA 一步法檢測(cè)試劑對(duì)娛樂(lè)場(chǎng)所2107 名服務(wù)人員進(jìn)行梅毒抗體檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本或灰區(qū)標(biāo)本用TPPA 試劑進(jìn)行確認(rèn)， 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

本市娛樂(lè)場(chǎng)所服務(wù)人員共2107 名，其中男性488 名，女性1619 名。

1.2 試劑

TP-ELISA 一步法試劑采用上?？迫A公司生產(chǎn)的，TPPA 試劑采用日本富士公司生產(chǎn)的，RPR 試劑采用上?？迫A公司生產(chǎn)的，所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.3 方法

應(yīng)用TP-ELISA 試劑對(duì)2107 份標(biāo)本檢測(cè)，對(duì)灰區(qū)標(biāo)本按1:8，1：16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀釋倍數(shù)檢測(cè)， 最后用TPPA 試劑對(duì)陽(yáng)性和灰區(qū)標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，并做RPR 滴度試驗(yàn)，灰區(qū)OD 值范圍設(shè)定為0.06～0.20。

1.4 儀器

RPR 旋轉(zhuǎn)儀為新康XK96-6 梅毒旋轉(zhuǎn)振蕩器，酶標(biāo)儀為SUNRISE，洗板機(jī)為TECAN。

2 結(jié)果

2.1 TP-ELISA、TPPA 和RPR 檢測(cè)情況

TP-ELISA 法檢出陽(yáng)性標(biāo)本96 份，經(jīng)TPPA 確認(rèn)均為陽(yáng)性，灰區(qū)標(biāo)本16 份，經(jīng)TPPA 確認(rèn)9 份 陽(yáng)性，7 份陰性。 105 份TPPA 陽(yáng)性標(biāo)本中，RPR 陽(yáng)性43 份，其中原滴陽(yáng)性12 份，1:2陽(yáng) 性13 份，1:4 陽(yáng) 性2 份，1:8 陽(yáng) 性5 份，1:16 陽(yáng) 性6 份，1:32陽(yáng)性5 份。

2.2 灰區(qū)標(biāo)本不同稀釋倍數(shù)檢測(cè)情況

TPPA 陽(yáng)性的9 份灰區(qū)標(biāo)本經(jīng)1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀釋檢測(cè)，結(jié)果顯示OD 值在1:16 和1:32 時(shí)為最高，反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性，RPR 滴度為1:8～1:32，見(jiàn)表1。

表1 9 份灰區(qū)標(biāo)本不同稀釋倍數(shù)檢測(cè)OD 值及RPR 滴度

2.3 灰區(qū)標(biāo)本兩步法檢測(cè)OD 值

將一步法試劑分成兩步進(jìn)行，即加血清溫育30 min，洗板后加酶標(biāo)抗原，溫育30 min 后顯色，結(jié)果9 份灰區(qū)標(biāo)本OD 值均明顯升高，見(jiàn)表1。

3 討論

TP-ELISA 是近年來(lái)隨著梅毒螺旋體基因工程抗原研究成功而建立的方法，操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、結(jié)果易于判斷等優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用。 但是當(dāng)標(biāo)本中梅毒螺旋體抗體濃度很高時(shí)會(huì)產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)，標(biāo)本OD 值會(huì)很低或處于灰區(qū)，易造成漏檢。 鉤狀效應(yīng)指待測(cè)標(biāo)本中抗原或抗體濃度的增加而升高至一定程度后，測(cè)定吸光度隨抗原或抗體濃度的增加而開(kāi)始下降直至不顯色，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問(wèn)題[1]。本次調(diào)查顯示9 份標(biāo)本OD 值處于灰區(qū)內(nèi)，TPPA 陽(yáng)性，RPR 滴度為1:8～1:32，分析其原因應(yīng)該是高濃度的抗體引起了鉤狀效應(yīng)，使標(biāo)本的OD 值偏低。其中兩份OD 值較低，分別是0.065和0.097，按照TP-ELISA 試劑說(shuō)明書，標(biāo)本OD 值>0.105 判定為陽(yáng)性，則這兩份標(biāo)本會(huì)漏檢，有關(guān)報(bào)道也指出ELISA 法檢測(cè)梅毒抗體的吸光度值在0.10～0.15 之間的標(biāo)本容易出現(xiàn)假陰性[2]。

解決鉤狀效應(yīng)的最好辦法就是采用兩步法試劑，酶標(biāo)抗原和抗體分兩步加入，不存在競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，可以避免鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生[3]，本次調(diào)查顯示9 份灰區(qū)標(biāo)本用兩步法檢測(cè)，OD 值均明顯升高，避免了灰區(qū)問(wèn)題。 同時(shí)本次調(diào)查顯示一步法試劑檢測(cè)稀釋后的灰區(qū)標(biāo)本，在1∶16 或1∶32 時(shí)獲得最強(qiáng)反應(yīng)，說(shuō)明存在鉤狀效應(yīng)的標(biāo)本可通過(guò)稀釋后檢測(cè)消除，這與有關(guān)報(bào)道相一致[1，4]。 另外，實(shí)際工作中我們發(fā)現(xiàn)，有一些TPPA 陽(yáng)性標(biāo)本，一步法檢測(cè)OD 值稍高于灰區(qū)，大約0.2～0.4 之間，二步法檢測(cè)反而呈陰性，這可能是二步法降低了實(shí)驗(yàn)的靈敏度。 因此TP-ELISA 一步法試劑初篩梅毒螺旋體抗體，對(duì)于灰區(qū)標(biāo)本，可以用稀釋法或二步法復(fù)測(cè)消除鉤狀效應(yīng)，做TPPA 試驗(yàn)確認(rèn)，同時(shí)可作RPR 滴度試驗(yàn)，能夠避免因鉤狀效應(yīng)造成的陽(yáng)性標(biāo)本漏檢，但是那些因鉤狀效應(yīng)引起的OD 值處于設(shè)定的灰區(qū)以下的標(biāo)本，還是有漏檢可能性。 如果初次檢測(cè)時(shí)，同步做血清原倍和1∶16 稀釋檢測(cè)，可以避免OD 值在灰區(qū)或以下的陽(yáng)性標(biāo)本漏檢，但相應(yīng)地增加了工作量，如果初檢直接用二步法，也可避免灰區(qū)陽(yáng)性標(biāo)本漏檢，但可能會(huì)漏檢部分弱陽(yáng)性標(biāo)本，因此這是個(gè)有待解決的問(wèn)題。

[1] 李金明.血液感染性疾病標(biāo)志物篩檢中應(yīng)重視的若干問(wèn)題[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜,2005,28(6):569-571.

[2] 李韶深,劉春莉,劉琳,等.梅毒ELISA 和TPPA 兩種試驗(yàn)方法的血清質(zhì)量控制的體會(huì)[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2005,19(3):183.

[3] 尹琦,徐玉.TP-ELISA 一步法在檢測(cè)梅毒螺旋體抗體中的鉤狀效應(yīng)分析[J].右江醫(yī)學(xué),2009,37(4)：421-423.

[4] 王海濱,林霞.ELISA 一步法與TPPA 法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體應(yīng)用分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(12):1438-1440.