郭建林，葛燕芬，孫小芹，李密密，夏 冰，杭悅宇

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護重點實驗室，江蘇南京210014〕

中國傳統(tǒng)中藥材蒼術為菊科(Compostiae)蒼術屬(Atractylodes DC.)植物南蒼術〔A.lancea(Thunb.)DC.〕和北蒼術〔A.chinensis(DC.)Koidz.〕的干燥根［1］。迄今為止，對蒼術原植物的分類處理仍有一定的爭議。《中國高等植物圖鑒》［2］將藥材蒼術的原植物定為南蒼術和北蒼術;而《中國植物志》［3］和《Flora of China》［4］則將南蒼術和北蒼術合并為蒼術〔A.lancea(Thunb.)DC.〕。

南蒼術又稱茅蒼術，主要分布于江蘇、浙江、安徽和湖北等狹小區(qū)域內，傳統(tǒng)認為江蘇茅山地區(qū)為南蒼術的道地產區(qū)。由于沒有進行規(guī)模性栽培，南蒼術的野生資源遭到掠奪式采挖，使得南蒼術特別是茅山的南蒼術野生資源瀕臨枯竭［5］。因而，有研究者建議將野生茅蒼術列入珍稀瀕危保護植物名錄中［6］。

已有研究表明:道地與非道地南蒼術在揮發(fā)油含量及組成上有明顯不同，江蘇分布的南蒼術揮發(fā)油的主成分是蒼術酮和蒼術素，而湖北分布的南蒼術揮發(fā)油的主成分則是蒼術醇和 β－桉葉醇［7－11］;王鳴等［12］的研究結果顯示:江蘇產南蒼術水溶性成分中主要含有蒼術苷A，與湖北產茅蒼術水溶性成分中的主成分有一定差異;但張貝貝等［13］綜合考慮南蒼術中蒼術素、β－桉葉醇、蒼術素醇和蒼術內酯Ⅱ含量指標，認為主產地南蒼術的質量優(yōu)于道地產區(qū)。為明確蒼術的遺傳變異狀況，任冰如等［14］采用RAPD標記對10個蒼術居群的遺傳關系進行了分析，結果顯示供試的7個南蒼術居群和3個北蒼術居群均具有較近的遺傳關系，南蒼術和北蒼術之間的差異較小，支持將北蒼術定為變種;郭蘭萍等［15］也采用RAPD方法對南蒼術和北蒼術進行了研究，結果表明蒼術的化學成分和遺傳分化與其地理分布均有一定的相關性，以地域為界劃分南蒼術和北蒼術有一定的道理。由此可見，不同產地南蒼術的有效成分均具有一定的變異，其藥材質量與產地存在一定的相關性，對其藥材道地性的確認難以有統(tǒng)一的標準，且對中藥蒼術原植物分類地位的確認仍較為混亂。

為了進一步明確蒼術種下遺傳變異狀況，了解不同產地南蒼術的遺傳差異，作者利用RAPD分子標記技術對南蒼術主要分布區(qū)(包括江蘇、湖北和安徽)7個野生居群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進行了比較，并采用聚類分析法對居群的遺傳關系進行了分析，以期為中藥蒼術原植物的確定及其藥材道地性的研究提供分子水平的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2003年11月、2006年4月和6月分別在湖北、江蘇和安徽7個南蒼術野生居群中確定28個樣株，樣株間距離不小于20 m;分別采集每一樣株的新鮮幼嫩葉片，用硅膠快速干燥后常溫密封保存、待用。采集樣品均經江蘇省·中國科學院植物研究所杭悅宇研究員鑒定，基本采集信息見表1。

DNA純化回收試劑盒購自北京萊博生物實驗材料研究所;RAPD引物由上海Invitrogen生物技術公司合成;10×PCR buffer(含Mg2+)、dNTPs和 Taq DNA 聚合酶均購自上海申能博彩生物科技有限公司;100 bp DNA ladder為Fermentas公司產品。使用的主要儀器有PE－9600型PCR擴增儀(美國Perkin Elmer公司)和WV－BP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)(江蘇捷達科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 提取及純化 參照 Paterson等［16］的CTAB法提取基因組總DNA，并加以改進。取1～3 g葉片，置入液氮中研磨至粉末狀，加入65℃提取緩沖液650 μL，65℃溫育1 h，期間每隔10 min輕輕搖晃1次;加入V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1混合液650 μL，輕輕顛倒搖晃后于室溫下靜置5～10 min;于4℃、12 000 r·min－1離心12 min，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，于－20℃冰箱中放置2 h;4℃、12 000 r·min－1離心 12 min，取沉淀;用體積分數(shù)70%乙醇洗滌沉淀，于4℃、12 000 r·min－1離心5 min，棄上清液，DNA沉淀自然風干;將獲得的DNA粗樣用DNA純化回收試劑盒進行純化后溶解于無菌雙蒸水中，－20℃貯藏、備用。1.2.2 PCR擴增反應及產物檢測 以江蘇湖山居群3個單株的基因組總DNA為模板進行RAPD引物篩選，從80條RAPD引物中選取18條擴增條帶豐富、信號強且穩(wěn)定性高的引物對所有單株的基因組總DNA進行PCR擴增。

表1 供試南蒼術7個居群的基本采集信息Table 1 Basic collection information of seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.tested

PCR反應在PE－9600型 PCR擴增儀上進行。反應體系總體積為20 μL，包括模板 DNA 30 ng、10×PCR buffer(含 Mg2+)2.0 μL、10 mmol·L－1dNTPs 0.3 μL、5 μmol·L－1引物 2.0 μL 和 5 U·μL－1Taq DNA聚合酶 0.2 μL，用滅菌雙蒸水補足至 20 μL。

擴增反應程序為:94℃預變性3 min;94℃變性45 s，38 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共 38 個循環(huán);最后于72℃延伸5 min。反應結束后將產物置于4℃保存。

將PCR擴增產物用質量體積分數(shù)1.4%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·mL－11×EB)電泳 1.5 h，用 WVBP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)進行觀察和拍照。電泳時以100 bp DNA ladder作為分子量標記。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將重復性好、清晰且遷移率相同的條帶作為同源位點進行處理，有條帶的位點記為“1”、無條帶的位點記為“0”，轉化為二元數(shù)據(jù)矩陣;應用 POPGENE v1.31軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、基因分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm);采用UPGMA法對7個居群28個單株間的遺傳關系進行聚類分析;居群內單株間和地區(qū)間、居群間的變異通過DCFA 1.1軟件和AMOVA法進行計算［17］。

2 結果和分析

2.1 RAPD擴增結果分析

利用篩選出的18條RAPD引物、以南蒼術7個居群28個單株的基因組總DNA為模板進行PCR反應，擴增結果詳見表2。由表2可見:引物E－04擴增出的條帶數(shù)最少，僅有4條，且沒有擴增出多態(tài)性條帶;引物AB－05和B－08擴增出的條帶數(shù)最多，達到15條，且引物B－08擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，達到13條;引物AH－15擴增出的多態(tài)性條帶百分率最高，達到90.00%。28個單株18條引物共擴增出193條重復性好且清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶有111條;平均每條引物擴增出10.72條帶，其中多態(tài)性條帶6.17條;多態(tài)性條帶百分率的平均值為57.51%，表明南蒼術種內遺傳多樣性及遺傳變異程度較低。

表2 用于南蒼術RAPD－PCR反應的引物序列及其擴增結果1)Table 2 Primersequencesused forRAPD-PCR reaction of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.and their amplification results1)

2.2 居群遺傳多樣性分析

南蒼術7個居群的遺傳多樣性指數(shù)見表3。結果表明:從省級水平看，多態(tài)性條帶百分率最高的為江蘇(45.60%)，湖北次之(44.04%)、安徽(19.17%)最低;而有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)均為湖北最高、江蘇次之、安徽最低。從居群水平看(蕪湖居群只有1個單株，無法計算各指標，因此不進行統(tǒng)計)，各居群多態(tài)性條帶百分率由高到低依次排序為湖北?？?、湖北英山、江蘇小九華山和湖山、江蘇小湯山、安徽金寨，而各居群有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)由高到低則均依次排序為湖北?？怠⒑庇⑸?、江蘇湖山、江蘇小九華山、江蘇小湯山、安徽金寨。從7個居群的總水平看，南蒼術的多態(tài)性條帶百分率、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)分別為 57.51%、1.317 4、0.187 2 和 0.282 7，表明南蒼術居群間的遺傳多樣性水平較低。

表3 南蒼術7個居群的遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.

2.3 居群間的聚類分析

基于RAPD標記分析結果獲得的南蒼術7個居群的遺傳距離見表4。由表4可見:7個居群間的遺傳距離為0.150 7～0.252 1，其中，安徽金寨和安徽蕪湖2個居群間的遺傳距離最小，僅為0.150 7;江蘇湖山和安徽蕪湖2個居群間的遺傳距離大，為0.252 1。

基于RAPD擴增結果，應用POPGENE v1.31軟件對7個居群28個南蒼術單株進行聚類分析，結果見圖1。聚類分析結果表明:來自同一個居群的單株均聚在一起，表明南蒼術同一居群單株間的遺傳變異較小，遺傳背景相似。根據(jù)聚類結果，7個居群首先可分為2組:第1組僅有湖北保康居群，顯示湖北保康居群與其他居群間有較遠的遺傳關系;第2組包含其余的6個居群，其中，安徽蕪湖居群的1個單株與安徽金寨居群聚在一起，表明它們之間可能具有較近的遺傳關系;湖北英山居群與江蘇小九華山居群首先聚在一起，隨后依次與江蘇小湯山、安徽金寨居群聚類，最后才與江蘇湖山居群聚在一起，表明江蘇湖山居群與江蘇其他2個居群具有一定的遺傳距離，而湖北英山居群與江蘇小九華山居群具有較近的遺傳關系，由此看出7個居群的聚類結果與居群的地理分布無明顯關系。

表4 基于RAPD標記分析的南蒼術7個居群的遺傳距離1)Table 4 Genetic distance among seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.based on RAPD marker analysis1)

圖1 基于Nei’s遺傳距離的南蒼術7個居群28個單株的聚類圖Fig.1 Cluster dendrogram of 28 individuals of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.from seven populations based on Nei’s genetic distance

2.4 居群間的遺傳分化分析

采用AMOVA法對供試南蒼術7個居群進行遺傳變異方差分析，結果表明:地區(qū)間、地區(qū)內居群間及居群內的變異分別占總變異的8.39%、29.88%和61.74%。而用POPGENE v1.31軟件計算出的基因分化系數(shù)(Gst)為0.206 5，即7個居群總的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(79.35%)，總變異的20.65%來自居群間，比AMOVA法的分析結果略低?；蛄?Nm)為1.921 5，說明供試南蒼術7個居群間沒有產生明顯的遺傳分化。

3 討 論

聚類分析結果顯示:位于湖北西部羅田地區(qū)的?？稻尤簡为毘山M，說明該居群的遺傳分化較其他居群明顯;而屬于大別山區(qū)的湖北英山和安徽金寨居群與屬于茅山地區(qū)的江蘇小九華山、江蘇小湯山和江蘇湖山居群聚為一組，表明后5個居群遺傳關系較近。這一結果與郭蘭萍等［18］的“湖北房縣與江蘇句容的南蒼術居群聚為一類”的研究結論相近，但與任冰如等［14］的“大別山區(qū)英山居群與其他各居群的遺傳距離最大”的結論有較大差異。南蒼術是一個外部形態(tài)多變且受地理－氣候環(huán)境影響很大的類群，有很多過渡類型，例如，胡世林等［19］報道了在大別山區(qū)鄰近的湖北羅田有1個穩(wěn)定的種下變異類群，定名為羅田蒼術(Atractylodes lancea subsp.luotlanensis Hu et Feng);彭華勝等［20］也認為大別山區(qū)外緣的低山地區(qū)(如桐城等地)分布的是典型的南蒼術的原形態(tài)類型，而在安徽潛山、舒城、岳西和金寨等地則分布著南蒼術和羅田蒼術的過渡類型。而從本研究結果看，湖北?？稻尤阂才c其他居群有較大的遺傳距離，存在種下變異的可能，其與其他居群的分類關系有待確定。

Bussell［21］基于 RAPD 數(shù)據(jù)分析了 35 種植物(其中29個為異交植物)的遺傳結構，結果表明:異交植物基因分化系數(shù)(Gst)的平均值為0.193，6種自交植物Gst的平均值為0.625。本研究中，各居群間的遺傳變異并不大，Gst為0.206 5，略高于異交植物Gst的平均值，但遠低于自交植物 Gst的平均值(0.59)［22］。Hogbin等［23］認為:異交物種的遺傳變異大多分布在群體內，群體間的遺傳變異通常占27%以下。本實驗結果與之相符。

基因流(Nm)對居群內遺傳變異的分化有重要影響，具有有限基因流的物種其遺傳分化往往大于那些具有廣泛基因流的物種。一般認為:Nm大于1，說明基因流能抑制居群內遺傳漂變的作用，防止居群分化;Nm小于1，說明遺傳漂變可導致居群明顯的遺傳分化［24－25］。南蒼術 7 個居群的 Nm為 1.921 5，遠低于異交和風媒植物 Nm的平均水平(5.380)［26］，但略高于一般廣布種的 Nm水平 (1.881)［27］。按照Slatkin［24］和 Hamrick 等［26］的觀點，若每代遷入個體數(shù)的Nm大于1，說明基因流足以抵制遺傳漂變的作用，同時也可防止居群分化的發(fā)生。在植物中，基因流是借助花粉、種子、孢子、植株個體以及其他攜有遺傳物質的物體為媒介進行的，其中花粉和種子的擴散是2種最主要的形式［28］。蒼術是自交不親和植物，主要靠昆蟲傳粉，異花授粉的結實率約為60%，且果實結實率受蟲害及天氣的影響很大，危害率達80%～90%，種子壽命僅為1 ～2 d［29－31］，因此，南蒼術居群間通過花粉與種子進行基因交流的概率比較小，這也是居群間遺傳分化不大的原因之一。

綜上所述，7個南蒼術居群整體的遺傳多樣性水平偏低，居群間遺傳分化不大，但由于它們在生物學特性及次生代謝產物組成上存在一定的差異，因而，建議可根據(jù)各居群主要成分的藥理作用選擇使用。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:150.

［2］中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒:第4冊［M］.北京:科學出版社，1975:601－602.

［3］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第七十八卷第一分冊［M］.北京:科學出版社，1987:23－28.

［4］WU Z Y，RAVEN P H，HONG D Y.Flora of China:Vol.20/21［M］.Beijing:Science Press，2011:40.

［5］賀善安，賀慧生，呂 曄，等.茅蒼術資源的保護和利用［J］.植物資源與環(huán)境，1993，2(1):1－6.

［6］宗世賢，袁昌齊，金九寧.江蘇省稀有瀕危藥用植物的現(xiàn)狀和保護［J］.中國野生植物資源，1996(1):1－5.

［7］TAKEDA O，MIKI E，TERABAYASLLI S，et al.Variation of essential oil components of Atractylodes lancea growing in China［J］.Natural Medicines，1995，49(1):18－23.

［8］吉 力，敖 平，潘炯光，等.蒼術揮發(fā)油的氣相色譜－質譜聯(lián)用分析［J］.中國中藥雜志，2001，26(3):182－185.

［9］郭蘭萍，劉俊英，吉 力，等.茅蒼術道地藥材的揮發(fā)油組成特征分析［J］.中國中藥雜志，2002，27(11):814－819.

［10］歐陽臻，楊 凌，宿樹蘭，等.茅蒼術揮發(fā)油的氣相色譜－質譜指紋圖譜研究［J］.藥學學報，2007，42(9):968－972.

［11］徐曉蘭，馮 煦，王 鳴，等.野生與栽培茅蒼術揮發(fā)油成分的比較分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2007，16(1):28－30.

［12］王 鳴，肖超成，陳 雨，等.不同產地茅蒼術水溶性成分的HPLC指紋圖譜研究［J］.植物資源與環(huán)境學報，2009，18(1):12－15.

［13］張貝貝，方 婧，許海玉，等.HPLC測定道地產地和主產地茅蒼術中β－桉葉醇及其他成分的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(8):116－118.

［14］任冰如，賀善安，於 虹，等.用RAPD技術評估蒼術居群間的親緣關系［J］.中草藥，2000，31(6):458－461.

［15］郭蘭萍，黃璐琦，王 敏，等.南北蒼術的RAPD分析及其劃分的初步探討［J］.中國中藥雜志，2001，26(3):156－158.

［16］PATERSON A H，BRUBAKER C L，WENDEL J F.A rapid method for extraction of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1993，11(2):122－127.

［17］張富明，葛 頌.群體遺傳學研究中的數(shù)據(jù)處理方法Ⅰ.RAPD數(shù)據(jù)的AMOVA分析［J］.生物多樣性，2002，10(4):438－444.

［18］郭蘭萍，黃璐琦，蔣有緒，等.蒼術遺傳結構的RAPD分析［J］.中國藥學雜志，2006，41(3):178－181.

［19］胡世林，馮學鋒，吉 力，等.蒼術及其異域變種［J］.中草藥，2000，31(10):781－784.

［20］彭華勝，王德群.南蒼術與野生白術的開花動態(tài)研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007，22(3):20－22.

［21］BUSSELL J D.The distribution of random amplified polymorphic DNA(RAPD)diversity among populations of Isotoma petraea(Lobeliaceae)［J］.Molecular Ecology，1999，8(5):775－789.

［22］NYBOM H.Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants［J］.Molecular Ecology，2004，13(5):1143－1155.

［23］HOGBIN P M，PEAKALL R.Evaluation of the contribution of genetic research to the management of the endangered plant Zieria prostrata［J］.Conservation Biology，1999，13(3):514－522.

［24］SLATKIN M.Gene flow and the geographic structure of natural populations［J］.Science，1987，236:787－792.

［25］劉占林，李 珊，閻桂琴，等.華山新麥草自然居群的遺傳結構和種內遺傳多態(tài)性研究［J］.遺傳學報，2001，28(8):769－777.

［26］HAMRICK J L，GODT M J W.Allozyme diversity in plant species［M］∥BROWN A H D，CLEGG M T，KAHLER A L，et al.Plant Population Genetics，Breeding and Genetic Resources.Sunderland:Sinauer Assoc Inc.，1995:43－63.

［27］HAMRICK J L.Gene Flow and Distribution of Genetic Variation in Plant Population［M］.New York:Academes Press，1987:53－67.

［28］黃璐琦.分子生藥學［M］.2版.北京:北京大學醫(yī)學出版社，2006:415－416.

［29］徐友貴，黃 弛.茅蒼術野生資源研究［J］.基層中藥雜志，1989，3(3):4－5.

［30］徐友貴，田中聯(lián)，王小明，等.茅蒼術生物學特性研究初報［J］.中國中藥雜志，1992，17(1):18－20.

［31］范瑞紅，徐 君，劉 征，等.蒼術人工栽培技術［J］.中國林副特產，2010(5):77－78.