王胐胐，李世朋，趙建龍，李文雅，丁雪貞，席守民

近些年來血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF在肝細(xì)胞癌血管生成和進(jìn)展中的作用被廣泛研究[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-2可以參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和血管的發(fā)生，被認(rèn)為在惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[2]。本文采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF、MMP-2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)及兩者的相關(guān)性，為肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本收集解放軍150中心醫(yī)院2007年6月～2011年8月接受肝細(xì)胞癌手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標(biāo)本32例與正常肝臟存檔石蠟標(biāo)本19例，所有病例均有完整臨床資料。

1.2主要試劑一抗兔抗人VEGF(美國BIOSS生產(chǎn))和兔抗人MMP-2(美國BIOSS生產(chǎn))，二步法免疫組化試劑盒(SP-0023)產(chǎn)自美國ZYMED公司，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(AR-0612)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3方法采用免疫組化并嚴(yán)格按照二步法免疫組化試劑盒操作說明書進(jìn)行染色。每例蠟塊4 μm 厚連續(xù)切片3張,其中1張進(jìn)行HE 染色,另2張進(jìn)行免疫組化染色。一抗體工作液濃度均為 1∶150。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,微波爐抗原熱修復(fù), 加封閉血清，最后進(jìn)行DAB 液顯色, 顯微鏡下控制，自來水沖洗終止反應(yīng), 蘇木素復(fù)染2 min, 鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，然后梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)用試劑盒中的陽性片作為陽性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞膜或胞漿染色呈棕黃色視為陽性，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果[3]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

VEGF、MMP-2染色主要存在于細(xì)胞漿，細(xì)胞膜亦有部分染色。VEGF在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于肝臟正常組織，差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。MMP-2在肝細(xì)胞癌組織中的陽性率顯著高于正常肝組織，差異具有顯著性(P<0.05)，見表2。采用配對(duì)資料的檢驗(yàn)計(jì)算相關(guān)系數(shù)r=0.497，P<0.05，表明兩種蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)存在高度相關(guān)性，見表3。

表1 VEGF在不同肝臟組織中的表達(dá)

表2 MMP-2在不同肝臟組織中的表達(dá)

表3 VEGF與MMP-2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤間質(zhì)血管生成，VEGF能通過旁分泌形式特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4-5]。Park等[6]發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞中都有VEGF的表達(dá)，而且隨著肝細(xì)胞癌組織血管形成的逐步發(fā)展，VEGF的表達(dá)程度也逐漸增加。本文通過采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中VEGF的表達(dá)，結(jié)果VEGF在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯然高于正常肝臟組織，說明本研究結(jié)果與Park等人的相符。因此表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一種增加血管通透性并促進(jìn)新血管生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)并與侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)行為關(guān)系密切，與腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)中的血管生成有關(guān)[7]。

ECM是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要屏障，而金屬蛋白酶MMPs是降解ECM最重要的酶類。MMPs主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞合成和分泌，廣泛分布于人體各組織?；|(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)依賴鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶基因家族，研究發(fā)現(xiàn)MMPs活性上調(diào)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。目前已發(fā)現(xiàn)多種，其中MMP-2可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠等多種底物，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中起著非常重要的作用。本文通過免疫組化方法對(duì)32例肝細(xì)胞癌組織和19例正常組織MMP-2表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MMP-2的陽性產(chǎn)物表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)，呈棕黃色。MMP-2在肝細(xì)胞癌組織中的陽性率顯著高于正常肝組織，差異具有顯著性(P<0.05)。因此可以說 MMP-2與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移可能都存在密切關(guān)系。

本文采用配對(duì)資料的檢驗(yàn)計(jì)算相關(guān)系數(shù)r=0.497，P<0.05，表明VEGF與MMP-2在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。因此推測(cè)VEGF和MMP-2在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中存在協(xié)同作用。

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