戴小燕(綜述)，方秋娟(審校)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，福州 350004;2.福建莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，福建莆田 351100)

Langendorff離體心臟灌注模型的制備及應(yīng)用

戴小燕1，2△(綜述)，方秋娟1※(審校)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，福州 350004;2.福建莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，福建莆田 351100)

離體心臟灌注模型通過(guò)主動(dòng)脈逆行插管灌注灌流液，經(jīng)冠狀動(dòng)脈血管營(yíng)養(yǎng)心肌，維持離體心臟持續(xù)搏動(dòng)，可用于器官水平心臟功能研究;或灌注含膠原酶的溶液分離單個(gè)心肌細(xì)胞用于心肌細(xì)胞或分子功能研究。根據(jù)研究目標(biāo)條件選用適宜動(dòng)物，成功制備離體心臟Langendorff灌注模型，需要選用合宜的灌注液、控制灌注壓力流量及溫度，嫻熟的麻醉取心、主動(dòng)脈插管及灌注操作，保證離體心臟良好灌注，才能制得功能良好的離體搏動(dòng)心臟或心肌細(xì)胞，用于心臟生理、藥理、臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究。其與在體心臟相比有一定局限性，但該模型制備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性好，適用于心臟功能學(xué)研究。

Langendorff;離體心臟;灌流;心肌細(xì)胞;心臟功能

利用心肌細(xì)胞特性，離體心臟通過(guò)灌注，一定時(shí)間內(nèi)能保持興奮和收縮功能。由于蛙心無(wú)冠狀動(dòng)脈循環(huán)且只有一個(gè)心室，最初的離體心臟研究大多在蛙心上完成。哺乳動(dòng)物心臟具有冠狀動(dòng)脈循環(huán)，無(wú)冠狀動(dòng)脈灌流，心臟很快停止跳動(dòng)。1895年，Langendorff［1］發(fā)明了哺乳動(dòng)物離體心臟灌流裝置，使哺乳動(dòng)物離體心臟的研究更加方便，因此該裝置迅速成為心血管基礎(chǔ)研究的重要工具?，F(xiàn)在，隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，包括心肌缺血/再灌注損傷、心肌細(xì)胞治療和移植心臟保存在內(nèi)的眾多研究取得重大突破?，F(xiàn)就該模型制備的基本方法、影響因素、臨床應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)予以綜述。

1 Langendorff離體心臟灌流原理

Langendorff模型采用主動(dòng)脈插管逆行灌注，提供心臟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使心臟保持跳動(dòng)。逆向灌注使主動(dòng)脈瓣關(guān)閉，灌流液通過(guò)左右冠狀動(dòng)脈開口進(jìn)入冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)心肌后，除了少量直接進(jìn)入心腔外，絕大多數(shù)通過(guò)心小、中、大靜脈匯集到冠狀竇，最后經(jīng)右心室和肺動(dòng)脈排出。

2 Langendorff模型制備方法

2.1 動(dòng)物準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射肝素(1000 U/kg)抗凝，防止冠狀動(dòng)脈及心室腔血栓形成。

手術(shù)前對(duì)動(dòng)物全麻。麻醉途徑有吸入和注射兩種方式。吸入麻醉效能強(qiáng)、易調(diào)控麻醉深度，但需要昂貴的麻醉及氣體清除設(shè)備，而且在缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)中具有心肌保護(hù)作用［2］;注射麻醉簡(jiǎn)單易行，麻醉誘導(dǎo)平穩(wěn)，但麻醉深度不易掌握。因此，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、研究?jī)?nèi)容及研究條件選擇合適的麻醉途徑。常見的小動(dòng)物(如小鼠、大鼠、豚鼠等)體形小，易固定，常采用腹腔注射;兔性情溫順，一般選擇耳緣靜脈注射;對(duì)于易傷人的犬、貓和體型較大且不易固定的動(dòng)物，可先肌內(nèi)注射，待其肌肉松弛、不具反抗力時(shí)，再視麻醉程度和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行靜脈麻醉［3］。

常用注射性麻醉劑有戊巴比妥鈉、水合氯醛、烏拉坦，吸入性麻醉劑有乙醚。單用10%水合氯醛300 mg/kg麻醉效果好，而且對(duì)循環(huán)系統(tǒng)影響?。?］。為避免單一用藥引起的麻醉過(guò)深或其它不良反應(yīng)，可使用復(fù)合麻醉。

2.2 取心臟 觀察動(dòng)物呼吸、角膜反射、肌松程度和疼痛反應(yīng)，判斷麻醉生效后，劍突下作切口，沿左右肋緣橫向剪開腹前壁，再依次沿左右腋中線縱向剪開兩胸側(cè)壁，將胸壁翻至頭側(cè)，打開心包膜，暴露心臟。左手拇指和食指輕輕提起心臟，暴露心底血管，迅速將其剪斷，取出的心臟立即放入4℃灌流液中停搏，降低心臟代謝防止缺血損傷。

2.3 主動(dòng)脈插管 在液面下夾住主動(dòng)脈斷端，將套管插入主動(dòng)脈，用縫線結(jié)扎固定，盡快恢復(fù)冠狀動(dòng)脈灌流。操作盡量輕巧，防止冠狀動(dòng)脈損傷。套管管徑與動(dòng)脈大小應(yīng)匹配。管徑過(guò)大，容易造成動(dòng)脈內(nèi)膜撕脫堵塞灌流口;管徑過(guò)小，灌流量不足，結(jié)扎時(shí)也易脫落。主動(dòng)脈插管深淺應(yīng)適宜，過(guò)淺灌流液從主動(dòng)脈分支漏出;過(guò)深，擋住冠狀動(dòng)脈入口甚至損傷主動(dòng)脈瓣造成瓣膜關(guān)閉不全導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈灌流不足。一般以右心房上緣約2 mm，不超過(guò)主動(dòng)脈瓣口為宜。插管時(shí)，讓液體緩慢滴下，防止形成氣栓堵塞冠狀動(dòng)脈。

如冠狀動(dòng)脈灌流成功，殘留在冠狀血管內(nèi)的血液瞬間沖出，數(shù)秒內(nèi)心搏恢復(fù)。從開胸腔到恢復(fù)冠狀動(dòng)脈灌流需在5 min內(nèi)完成，延遲灌注將導(dǎo)致缺血損傷?；謴?fù)灌流后，剪除多余組織，在肺動(dòng)脈根部剪一個(gè)小口，使灌流液流出通暢。

2.4 心室內(nèi)壓測(cè)定 心臟灌流5 min后，切開左心耳，經(jīng)切口向左心室插入球囊，另一端接多導(dǎo)生理記錄儀。向球囊緩慢注入生理鹽水，使囊內(nèi)壓為4～8 mm Hg。隨心臟節(jié)律性收縮與舒張即可檢測(cè)左心室收縮壓、舒張末壓等。

球囊心室測(cè)壓是利用球囊和心室壁的相互作用。球囊導(dǎo)管的質(zhì)量直接影響心室內(nèi)壓測(cè)定。由于市售的乳膠球囊普遍存在球囊過(guò)大、過(guò)硬等缺點(diǎn)，因此多采取自制球囊［5］。自制球囊的材料分彈性(乳膠薄膜)和非彈性(塑料薄膜)兩種，非彈性材料制作的球囊，變形能力差，舒張末壓難以調(diào)節(jié)。一般選擴(kuò)展性良好的乳膠薄膜。彈性球囊在心臟舒張時(shí)，囊內(nèi)液體要克服彈性膜產(chǎn)生的張力，表現(xiàn)為心室舒張速度下降，所以研究心臟舒張功能實(shí)驗(yàn)，使用非彈性膜制作球囊較好［6］。

2.5 心室起搏 在研究藥物對(duì)離體心臟傳導(dǎo)、復(fù)極、冠狀動(dòng)脈流量的影響時(shí)，加藥前后要保持固定心率。通過(guò)心室起搏，就能消除自主心率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在心臟移植供心保存實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也通過(guò)起搏來(lái)保持心率和左心室收縮壓力的穩(wěn)定，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

3 影響模型穩(wěn)定的因素

3.1 灌注溫度 高溫灌注會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡，心肌收縮力及冠狀動(dòng)脈流量下降。特別是41.5℃以上高溫對(duì)離體心臟功能抑制和結(jié)構(gòu)損傷明顯，且隨著溫度的升高，抑制和損傷程度加重［7］。低溫灌注會(huì)引起心率減慢，心舒張期延長(zhǎng)，心室舒張末期容積增加，心肌收縮力增強(qiáng)［8］。因此，維持灌注溫度恒定至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)中，常用恒溫循環(huán)器將灌流系統(tǒng)的灌流液及器官浴槽等溫度保持在(37±0.5)℃。

3.2 灌流液的成分 離體心臟的存活離不開能量供應(yīng)，以維持正常代謝和跨膜離子濃度。灌流液是維持心臟收縮的能量來(lái)源。Langendorff模型中常用晶體灌流液，也有報(bào)道用血液及紅細(xì)胞灌流液。

3.2.1 晶體溶液灌流 迄今為止，Langendorff灌流哺乳動(dòng)物心臟最常見的碳酸氫鹽緩沖液為Sutherland等［9］所創(chuàng)建，簡(jiǎn)稱為 KH液。其成分為(mmol/L)：NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl22.5，NaHCO325，MgSO41.2，KH2PO41.2，葡萄糖 11，持續(xù)充以 95%O2和5%CO2混合氣體，pH 7.4。

傳統(tǒng)的KH液缺少蛋白質(zhì)，不能結(jié)合多余離子鈣，溶液中游離鈣離子超過(guò)生物可利用度。高鈣灌流下的心功能接近鈣離子量效關(guān)系的上限。同時(shí)，溶液中葡萄糖含量過(guò)高，代謝時(shí)中間產(chǎn)物的堆積容易造成組織損害。研究者根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)KH液進(jìn)行修正，使鈣離子(1.2～1.8 mmol/L)更接近生理鈣濃度;同時(shí)降低葡萄糖濃度或用丙酮酸鹽、游離脂肪酸替代部分葡萄糖作為底物提供能量。

3.2.2 血液灌流 1970年，Gamble等［10］報(bào)道采用活體大鼠提供氧合血來(lái)灌注另一只大鼠離體心臟。供血大鼠常規(guī)肝素抗凝、麻醉，機(jī)械通氣支持，左股動(dòng)脈和右股靜脈插管，其中左股動(dòng)脈流出的血液，經(jīng)蠕動(dòng)泵逐漸增加灌注流量，通過(guò)主動(dòng)脈插管逆行灌注另一只大鼠的離體心臟。冠狀動(dòng)脈流出的血液與預(yù)充的琥珀酰明膠注射液混合、過(guò)濾后，經(jīng)右股靜脈回到供血大鼠體內(nèi)。

血液灌流的離體心臟功能穩(wěn)定，心功能降低速率每小時(shí)不超過(guò)5%，組織水腫較輕，冠狀動(dòng)脈流量接近生理正常值。灌流過(guò)程易產(chǎn)生進(jìn)行性溶血，且離體心臟與供血大鼠的代謝物質(zhì)通過(guò)循環(huán)互相影響，供血大鼠生命體征的惡化直接威脅到離體心臟的存活。

3.2.3 紅細(xì)胞懸液灌流 1979年有文獻(xiàn)報(bào)道，用含25%～40%比容的羊紅細(xì)胞懸液灌流兔心［11］。新鮮羊血肝素抗凝，200 μm濾膜過(guò)濾，反復(fù)1000×g離心、棄上清，重懸至上清液澄清透明。洗好紅細(xì)胞液按所需紅細(xì)胞比容加入含4%右旋糖酐與3 g白蛋白的KH液中。

與血液灌流相似，紅細(xì)胞灌流離體心臟穩(wěn)定性較好。由于去除白細(xì)胞和血漿蛋白，排斥免疫反應(yīng)較輕。紅細(xì)胞懸液制作繁瑣，在氧合過(guò)程中需要專用膜式氧合器，且氧合過(guò)程容易發(fā)生溶血。

3.3 灌注壓 離體心臟灌注過(guò)程中，應(yīng)維持灌注壓恒定。灌注壓波動(dòng)過(guò)大，易損傷冠狀動(dòng)脈造成心肌水腫，加重缺血/再灌注損傷［12］;壓力過(guò)低，冠狀動(dòng)脈灌注不足;而壓力過(guò)高，會(huì)損傷主動(dòng)脈瓣。因此，灌流瓶的高度一般應(yīng)距心臟60～80 cm，可按心臟大小適當(dāng)調(diào)整，以冠狀動(dòng)脈流量為5～8 mL/min為宜［13］。

3.4 灌流系統(tǒng)的清潔 灌流管道尤其管道連接處，細(xì)菌極易繁殖，形成菌斑和菌塊堵塞冠狀動(dòng)脈。因此每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用70%乙醇灌洗15 min，再用無(wú)菌蒸餾水清洗10 min。每2周1次使用去污劑或稀鹽酸灌流管道，再用大量蒸餾水沖洗以保持管道清潔。

4 Langendorff模型的優(yōu)缺點(diǎn)

該模型的優(yōu)點(diǎn)是制備簡(jiǎn)單，操作方便，費(fèi)用低廉;實(shí)驗(yàn)因素容易控制，穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)［14］;無(wú)其他器官影響及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，整體干擾因素較少，有利于單個(gè)實(shí)驗(yàn)因素研究［15］。此外，適用制備該模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多樣。幾乎所有哺乳動(dòng)物及部分非哺乳動(dòng)物(如鳥類)的心臟都適合離體灌流。盡管如此，由于成本、血管變異性、麻醉操作難度、灌流液需要量等因素，豬、猴、羊等大型動(dòng)物的心臟灌流相對(duì)較少。鼠類成本低、繁殖快是心血管研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。其中最常用的是大鼠，但大鼠心肌動(dòng)作電位時(shí)程短，缺血后心律失常室顫率較高，一般不用于心律失常及抗心律失常藥物的研究［16］。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，小鼠的使用日益廣泛。由于小鼠的體型小、心率快，建立離體心臟模型具有一定難度［17］，研究者可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求選擇不同的動(dòng)物。

不足之處是Langendorff模型灌注方式與生理狀態(tài)不符，左心室空虛，心臟不能做功，因此不適于模擬并研究在體心臟功能，也無(wú)法直接觀察心室收縮力和氧化代謝的關(guān)系。同時(shí)離體心臟維持時(shí)間有限，隨著時(shí)間推移，心臟各項(xiàng)功能逐漸衰竭。由于內(nèi)外環(huán)境的巨大差異及缺少正常生理調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體模型存在一定差異［18］。

5 Langendorf模型的應(yīng)用

5.1 制備心律失常模型 經(jīng)灌流管注入藥物誘發(fā)心律失?；蛐泄跔顒?dòng)脈左前降支結(jié)扎造成缺血/再灌注心律失常，可研究心律失常的發(fā)生、發(fā)展，還可通過(guò)給藥觀察藥物的抗心律失常效應(yīng)。同時(shí)運(yùn)用心電信號(hào)設(shè)備，觀察離體心臟表面心電圖、His束電圖、心房和心室單相動(dòng)作電位，對(duì)心臟不同部位心肌的興奮性、傳導(dǎo)性、自律性以及心肌復(fù)極過(guò)程進(jìn)行全面評(píng)估［19］。

5.2 藥物等對(duì)心臟的藥理學(xué)效應(yīng) 建立Langendorff模型后，將藥物經(jīng)心臟套管側(cè)管注入心臟或用灌流液配成一定濃度進(jìn)行主動(dòng)脈灌流，對(duì)比加藥前后的心功能變化，監(jiān)測(cè)藥物的量-效關(guān)系，對(duì)藥物進(jìn)行治療效果評(píng)價(jià)和效價(jià)測(cè)定;并對(duì)冠狀動(dòng)脈流出液和心臟組織進(jìn)行生化或分子生物學(xué)分析來(lái)研究藥物信號(hào)通路。

5.3 制備缺血/再灌注模型 Langendorff離體心臟灌流適于離體心臟缺血/再灌注模型、缺血預(yù)處理與缺血后處理模型的構(gòu)建，并進(jìn)行缺血和缺氧效應(yīng)相關(guān)研究。

不同程度或不同等級(jí)的全心缺血可以通過(guò)完全阻斷(通過(guò)夾閉流入管道)或部分限制灌注液流速獲得［20］。心臟局部缺血可以通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)。不同缺血時(shí)間造成缺血損傷程度不同。短時(shí)間缺血引起心肌頓抑，長(zhǎng)時(shí)間缺血造成心肌梗死。一般30 min內(nèi)的全心缺血為可逆性損傷，進(jìn)行缺血前預(yù)處理能有效減少梗死面積。在缺血或再灌注初期收集冠狀動(dòng)脈流出液檢測(cè)心肌代謝的標(biāo)志物或在再灌注末期對(duì)心臟組織進(jìn)行心肌生化和代謝分析。

5.4 分離心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞是心臟的基本功能單位。在細(xì)胞水平直接觀察生理或病理狀態(tài)下心肌活動(dòng)的改變，能提供最直接的心臟功能信息。利用Langendorff灌流裝置在灌流液中加入生物酶，將含有膠原組織、透明質(zhì)酸和纖維組織等細(xì)胞間質(zhì)消化，使心肌細(xì)胞相互分開，能獲得單個(gè)心肌細(xì)胞。

5.5 移植心臟保存 良好的心臟保存是心臟移植成功的保證。長(zhǎng)于4 h的保存時(shí)間會(huì)導(dǎo)致心臟不可逆的功能障礙。臨床實(shí)踐中，供體心臟往往來(lái)源于另外一個(gè)地區(qū)，那么增加數(shù)小時(shí)的保存時(shí)間將有重大意義。Fitton等［21］改進(jìn)了灌流裝置以保證移植前24 h心臟不間斷的低溫灌注，為供移植心臟提供了一個(gè)有效的保存方法。

6 結(jié)語(yǔ)

從19世紀(jì)末發(fā)明至今，Langendorff離體心臟灌注模型存在自身局限性，但是憑借其較高的可重復(fù)性、良好的穩(wěn)定性和相對(duì)較低的技術(shù)要求等優(yōu)點(diǎn)，該模型在探索心肌收縮功能、心肌電生理、冠狀動(dòng)脈血管功能等研究中發(fā)揮著不可替代的作用，為在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人類心肌保護(hù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，成為心血管研究領(lǐng)域中最為廣泛使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭弧?/p>

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Preparation and Application of Langendorff Isolated Heart Perfusion Model
1

DAI Xiao-yan1，2，F(xiàn)ANG Qiu-juan.(1.Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350004，China;2.Experiment Center，Medical College of Putian University，Putian351100，China)

The isolated heart perfusion model is set up by perfusion through the catheter intubated backward into aorta to coronary artery to supply myocardium nutrition to keep the isolated heart beating.It can be used in heart function study at organ level;or it can also be perfused with solution containing collagenase for preparation isolated myocytes used in the study of the myocyte function at cell or molecule level.The kind of animal selected for Langendorff perfusion is decided by research purpose and condition.To prepare an ideal Langendorff perfusion heart needs appropriate solution and perfusion pressure and temperature，skilled anaesthesia heart taking and intubating aorta and perfusing operation，ensuring good heart perfusion，which are essential to get functional isolated beating heart or myocytes for the study of heart physiology，pharmacology or clinical basic application.Although it has some limits compared with the heart in vivo，the preparation of isolated Langendorff perfusion heart is easy and economical with good repeatability，making it appropriate for the heart function research.

Langendorff;Isolated heart;Perfusion;Myocyte;Heart function

R33

A

1006-2084(2012)13-2036-04

福建省教育廳科技重點(diǎn)項(xiàng)目(JA07081)

2011-11-30

2012-02-23 編輯：伊姍