余 艷，羅 振(綜述)，程臘梅(審校)

(中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞研究所，長沙 410078)

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有高度自我更新、多向分化潛能，能長期重建各系造血和免疫功能。HSCs移植是治療白血病、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病和某些實(shí)體瘤(淋巴瘤、乳腺癌等)的有效手段。自1989年首次利用臍血干細(xì)胞移植治療范科尼貧血報(bào)道以來，臍血干細(xì)胞移植受到了廣泛的關(guān)注。但由于臍血中HSCs的數(shù)量有限，臍血干細(xì)胞移植治療主要應(yīng)用于兒童和低體質(zhì)量患者。為滿足大齡兒童和成年患者臍血HSCs移植的需求，需通過體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的HSCs。近年來隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，人們對HSCs生物學(xué)和造血調(diào)節(jié)有了更深入的了解，HSCs體外擴(kuò)增效率得到了極大的提高。

1 添加細(xì)胞因子擴(kuò)增HSCs

將骨髓、外周血或臍血來源的HSCs，置于含有多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)是早期體外擴(kuò)增HSCs的主要方法。不同實(shí)驗(yàn)室所用細(xì)胞因子組合也不盡相同，但是通常都含有干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-3、IL-6 和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)，F(xiàn)lt-3/Flk2配體(Flt-3/Flk-2 Ligand， FL)。SCF和FL主要作用造血干/祖細(xì)胞，促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞分裂和增殖，抑制凋亡［1］;IL-3主要刺激造血祖細(xì)胞的增殖和分化［2］;TPO 能夠廣泛作用于造血細(xì)胞的各個(gè)階段，主要調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞系的分化［3］。應(yīng)用上述細(xì)胞因子組合擴(kuò)增HSCs，雖然造血細(xì)胞的總數(shù)和造血祖細(xì)胞數(shù)量得到了顯著的擴(kuò)增，但原始HSCs在體外擴(kuò)增過程中發(fā)生分化，擴(kuò)增后的造血細(xì)胞降低了自我更新和重建造血的能力［4］。因此，在擴(kuò)增HSCs的同時(shí)，如何維持干細(xì)胞特性是HSCs體外擴(kuò)增中亟待解決的問題。

近年來，人們對造血微環(huán)境的調(diào)控作用有了更深入的了解，發(fā)現(xiàn)造血微環(huán)境中的某些蛋白質(zhì)對維持HSCs的不分化和自我更新具有重要作用，因此嘗試將這些蛋白質(zhì)用于HSCs的體外擴(kuò)增。原始HSCs表達(dá)Notch信號(hào)分子受體，活化Notch信號(hào)能抑制HSCs分化，促進(jìn)HSCs增殖，但是Notch的配體Delta-1在可溶狀態(tài)下雖能與Notch結(jié)合，卻不能活化該信號(hào)通路［5］。Delaney等［6-7］將 Delta-1 的胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列與IgG1的Fc域的編碼序列融合，純化得到Delta-1 ext-IgG;在體外擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)先將Delta-1ext-IgG固定于培養(yǎng)器皿中，固定化的Delta-1 ext-IgG能夠激活 HSCs的 Notch信號(hào)通路;利用固定化的Delta-1ext-IgG輔以細(xì)胞因子 SCF、FL、IL-6、IL-3、TPO擴(kuò)增HSCs，培養(yǎng)17～21 d，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)222倍，同時(shí)造血重建能力增強(qiáng)16倍。

Wnt蛋白是一類分泌型糖蛋白，參與HSCs的自我更新和分化的調(diào)節(jié)。β連鎖蛋白是Wnt信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子，Wnt蛋白與受體結(jié)合后抑制β連鎖蛋白的磷酸化，導(dǎo)致胞內(nèi)β連鎖蛋白聚集，繼而進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子家族作用，促進(jìn)特定基因的表達(dá)?；罨摩逻B鎖蛋白或Wnt1的過量表達(dá)能夠抑制HSCs分化，促進(jìn)HSCs的增殖［8］。此外，地諾前列酮也可通過上調(diào)β連鎖蛋白的表達(dá)作用于Wnt信號(hào)通路，參與HSCs增殖和分化的調(diào)節(jié)［9］。

多效蛋白(pleiotrophin，PTN)是在許多組織和細(xì)胞系中廣泛表達(dá)的分泌型肝素結(jié)合蛋白，該蛋白不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移，還參與血管的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)PTN對小鼠HSCs的維持至關(guān)重要，同時(shí)還能促進(jìn)人臍血HSCs的體外擴(kuò)增。Himburg等［10］運(yùn)用PTN聯(lián)合細(xì)胞因子SCF、FL和TPO擴(kuò)增人臍血CD34+CD38-細(xì)胞，HSCs可擴(kuò)增近40倍;將擴(kuò)增后的細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，4周后檢測到小鼠外周血中人源的細(xì)胞數(shù)是對照組的3倍，8周后增加至7倍。

2 添加化學(xué)分子擴(kuò)增HSCs

臨床研究發(fā)現(xiàn)銅離子(Cu2+)在HSCs的發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，Cu2+能使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。體外培養(yǎng)臍血干細(xì)胞時(shí)，Cu2+能夠增加活性氧的濃度，促進(jìn)HSCs分化;在含有細(xì)胞因子(SCF、TPO、FL和 IL-6)的培養(yǎng)體系中加入Cu2+螯合劑四乙烯戊胺(tetraethylenepentamine，TEPA)，CD34+細(xì)胞可擴(kuò)增159倍，為對照組的 3.5 倍［11］。HSCs擴(kuò)增劑(StemRegenin 1，SR1)是一種嘌呤衍生物，在含SCF、FL和IL-6細(xì)胞因子的無血清培養(yǎng)體系中，加入SR1，人臍血CD34+細(xì)胞可擴(kuò)增50倍，SRCs擴(kuò)增達(dá)17倍［12］。

p38是屬于細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化、衰老和凋亡過程。當(dāng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時(shí)，p38在HSCs的自我更新和正常的造血過程中不發(fā)揮作用，但是在氧化應(yīng)激條件下活化的p38則誘導(dǎo)HSCs衰老［13-14］。SB203580是一種小分子化合物，能夠特異性抑制p38的活性。在正常的含氧條件下(21%)p38的活化抑制HSCs的擴(kuò)增，加入SB203580后，HSCs的擴(kuò)增效率增加2 倍［15］。

3 基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增HSCs

HSCs自我更新、多向分化均依賴于HSCs所處的微環(huán)境。微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)及造血細(xì)胞本身均參與造血穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。骨髓造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，這些基質(zhì)細(xì)胞在體外對HSCs均有不同程度的擴(kuò)增作用［16］。Kawano等［17］將人端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞建立基質(zhì)細(xì)胞系，支持臍血CD34+細(xì)胞體外增殖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也具有擴(kuò)增HSC/HPC的作用，臍血單個(gè)核細(xì)胞與充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)14 d，CD133+細(xì)胞和CD34+細(xì)胞可分別擴(kuò)增30倍和8倍，集落形成單位擴(kuò)增約200倍［18］。小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源的OP9細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Delta-1基因后，在擴(kuò)增造血HSCs的同時(shí)，能有效地促進(jìn)CD34+CD38-Lin-的自我更新［19］。此外，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)也能有效促進(jìn)HSCs的體外擴(kuò)增。在共培養(yǎng)體系中，ECs表達(dá)的Notch配體，激活HSCs的 Notch信號(hào)，抑制 HSCs的分化，促進(jìn)HSCs增殖的同時(shí)能保持HSCs的自我更新潛能［20］。轉(zhuǎn)染了E4ORF1基因的ECs(E4ORF1+ECs)能夠在無血清和細(xì)胞因子的條件下長期培養(yǎng)［21］。為了排除ECs生長所需的生長因子對HSCs擴(kuò)增的影響，Butler等［20］利用 E4ORF1+ECs與 HSCs在無血清和細(xì)胞因子的情況下進(jìn)行共培養(yǎng)，擴(kuò)增后的HSCs能夠長期植入所有的受體小鼠體內(nèi)?；|(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)較單純用細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系，擴(kuò)增HSCs的效率更高，但共培養(yǎng)體系成分復(fù)雜，影響因素較多，不便于大規(guī)模的擴(kuò)增培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)化，并且異體的基質(zhì)細(xì)胞有排斥和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，不適合臨床上的應(yīng)用。

4 HSC基因修飾

SALL4是一種新發(fā)現(xiàn)的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎干細(xì)胞多能性的維持至關(guān)重要［22］。SALL4在人白血病細(xì)胞系和早期急性髓性白血病細(xì)胞中表達(dá)，可能與正常HSCs的自我更新有關(guān)［23-24］。SALL4基因過表達(dá)的CD34+細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)2個(gè)月后，HSC擴(kuò)增可達(dá)10 000～15 000倍，并且植入能力和長期重建造血能力均得到顯著增強(qiáng)［25］。

除了HSCs體外擴(kuò)增效率外，HSCs的植入率也是影響HSCs移植成功與否的關(guān)鍵。CD34+細(xì)胞過表達(dá)CXCR4基因，能夠增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1介導(dǎo)的趨化作用，增加HSCs移植后的植入率，提高HSCs移植的成功率［26］。

5 其他方法

骨髓血液中的氧張力較其他組織低，相當(dāng)于頸靜脈血的氧張力［27］。細(xì)胞周期緩慢的HSCs趨向于定植在遠(yuǎn)離血管的低氧區(qū)，細(xì)胞周期活躍的HSCs位于血管附近的區(qū)域［28］。低氧條件培養(yǎng)CD34+細(xì)胞能夠提高其植入后造血重建能力［29］。低氧環(huán)境中的HSCs保持低的擴(kuò)增速率避免氧化應(yīng)激的損傷，并且能夠表達(dá)更高水平的Notch-1、端粒酶和細(xì)胞周期抑制因子 p21［30］。

納米纖維是一種能滲透的纖維，具有可控制的拓?fù)涮匦?，這種結(jié)構(gòu)能夠顯著提高表面積與體積比。以納米纖維作為支架材料，模擬體內(nèi)造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)擴(kuò)增HSCs，能明顯提高HSCs的擴(kuò)增效率。將網(wǎng)狀的納米纖維材料黏附于24孔培養(yǎng)板底部，將臍血來源的CD133+細(xì)胞加入到納米材料制成的支架上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，擴(kuò)增培養(yǎng)10 d后細(xì)胞總數(shù)增加了225倍，并且仍高表達(dá) CD133(24%)和 CD34(93%)［31］。近年來用旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器來擴(kuò)增培養(yǎng)HSC，細(xì)胞數(shù)可擴(kuò)增435倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增 30 余倍［32］。生物反應(yīng)器的利用避免了共培養(yǎng)異體基質(zhì)細(xì)胞疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，降低了成本，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

6 展望

進(jìn)一步優(yōu)化HSCs擴(kuò)增培養(yǎng)體系，提高HSCs的擴(kuò)增效率，為臨床移植治療提供充足的HSCs，需要更加深入地研究HSCs增殖、分化機(jī)制，尋找最佳的細(xì)胞因子組合，并利用生物工程技術(shù)，建立更加優(yōu)化的大規(guī)模培養(yǎng)裝置。另外，可通過尋找新的HSCs來源，以滿足日益增長的HSCs需求，例如利用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞在體外向造血定向誘導(dǎo)分化。此外，擴(kuò)增的HSCs用于臨床前還需要進(jìn)行大量的隨機(jī)臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證其安全性和有效性。隨著干細(xì)胞領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展，移植技術(shù)的不斷完善，擴(kuò)增的臍血HSCs將更加廣泛地應(yīng)用于臨床治療中。

［1］ Mohamed AA，Ibrahim AM，El-Masry MW，et al.Ex vivo expansion of stem cells:defining optimum conditions using various cytokines［J］.Lab Hematol，2006，12(2):86-93.

［2］ Astori G，Malangone W，Adami V.et al.A novel protocol that allows short-term stem cell expansion of both committed and pluripotent hematopoietic progenitor cells suitable for clinical use［J］.Blood Cells Mol Dis，2001，27(4):715-724.

［3］ Woo SY，Kie JH，Ryu KH，et al.Megakaryothrombopoiesis during ex vivo expansion of human cord blood CD34+cells using thrombopoietin［J］.Scand J Immunol，2002，55(1):88-95.

［4］ Shih CC，Hu MC，Hu J，et al.Long-term ex vivo maintenance and expansion of transplantable human hematopoietic stem cells［J］.Blood，1999，94(5):1623-1636.

［5］ Varnum-Finney B，Wu L，Yu M，et al.Immobilization of Notch ligand，Delta-1，is required for induction of notch signaling［J］.J Cell Sci，2000，113 Pt 23:4313-4318.

［6］ Delaney C，Varnum-Finney B，Aoyama K，et al.Dose-dependent effects of the Notch ligand Delta1 on ex vivo differentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord blood cells［J］.Blood，2005，106(8):2693-2699.

［7］ Delaney C，Heimfeld S，Brashem-Stein C，et al.Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution［J］.Nature Medicine，2010，16(2):232-236.

［8］ Staal FJ，Clevers HC.WNT signalling and haematopoiesis:a WNTWNT situation［J］.Nat Rev Immunol，2005，5(1):21-30.

［9］ Goessling W，North TE，Loewer S，et al.Genetic interaction of PGE2 and Wnt signaling regulates developmental specification of stem cells and regeneration［J］.Cell，2009，136(6):1136-1147.

［10］ Himburg HA，Muramoto GG，Daher P，et al.Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells［J］.Nature Medicine，2010，16(4):475-482.

［11］ Peled T，Landau E，Mandel J，et al.Linear polyamine copper chelator tetraethylenepentamine augments long-term ex vivo expansion of cord blood-derived CD34+cells and increases their engraftment potential in NOD/SCID mice［J］.Exp Hematol，2004，32(6):547-555.

［12］ Boitano AE，Wang J，Romeo R，et al.Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells［J］.Science，2010，329(5997):1345-1348.

［13］ Navas TA，Mohindru M，Estes M，et al.Inhibition of overactivated p38 MAPK can restore hematopoiesis in myelodysplastic syndrome progenitors［J］.Blood，2006，108(13):4170-4177.

［14］ Zhou L，Opalinska J，Verma A.p38 MAP kinase regulates stem cell apoptosis in human hematopoietic failure［J］.Cell Cycle，2007，6(5):534-537.

［15］ Wang Y，Kellner J，Liu L，et al.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase promotes ex vivo hematopoietic stem cell expansion［J］.Stem Cells Dev，2011，20(7):1143-1152.

［16］ Nagasawa T，Omatsu Y，Sugiyama T.Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche:the role of reticular cells［J］.Trends Immunol，2011，32(7):315-320.

［17］ Kawano Y，Kobune M，Yamaguchi M，et al.Ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerase catalytic subunit(hTERT)-transfected human stromal cells［J］.Blood，2003，101(2):532-540.

［18］ Robinson SN，Ng J，Niu T，et al.Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Bone Marrow Transplant，2006，37(4):359-366.

［19］ Fernández-Sánchez V，Pelayo R，F(xiàn)lores-Guzmán P，et al.In vitro effects of stromal cells expressing different levels of Jagged-1 and Delta-1 on the growth of primitive and intermediate CD34+cell subsets from human cord blood［J］.Blood Cells Mol Dis，2011，47(4):205-213.

［20］ Butler JM，Nolan DJ，Vertes EL，et al.Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells［J］.Cell Stem Cell，2010，6(3):251-264.

［21］ Seandel M，Butler JM，Kobayashi H，et al.Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(49):19288-19293.

［22］ Yang J，Gao C，Chai L，et al.A novel SALL4/OCT4 transcriptional feedback network for pluripotency of embryonic stem cells［J］.PLoS One，2010，5(5):e10766.

［23］ Ma Y，Cui W，Yang J，et al.SALL4，a novel oncogene，is constitutively expressed in human acute myeloid leukemia(AML)and induces AML in transgenic mice［J］.Blood，2006，108(8):2726-2735.

［24］ Yang J，Chai L，Gao C，et al.SALL4 is a key regulator of survival and apoptosis in human leukemic cells［J］.Blood，2008，112(3):805-813.

［25］ Aguila JR，Liao W，Yang J，et al.SALL4 is a robust stimulator for the expansion of hematopoietic stem cells［J］.Blood，2011，118(3):576-585.

［26］ Kahn J，Byk T，Jansson-Sjostrand L，et al.Overexpression of CXCR4 on human CD34+progenitors increases their proliferation，migration，and NOD/SCID repopulation［J］.Blood，2004，103(8):2942-2949.

［27］ Grant WC，Root WS.The relation of O2in bone marrow blood to post-hemorrhagic erythropoiesis［J］.Am J Physiol，1947，150(4):618-627.

［28］ Kubota Y，Takubo K，Suda T.Bone marrow long label-retaining cells reside in the sinusoidal hypoxic niche［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366(2):335-339.

［29］ Eliasson P，J?nsson JI.The hematopoietic stem cell niche:low in oxygen but a nice place to be［J］.J Cell Physiol，2010，222(1):17-22.

［30］ Lekli I，Gurusamy N，Ray D，et al.Redox regulation of stem cell mobilization［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87(12):989-995.

［31］ Das H，Abdulhameed N，Joseph M，et al.Ex vivo nanofiber expansion and genetic modification of human cord blood-derived progenitor/stem cells enhances vasculogenesis［J］.Cell Transplantation，2009，18(3):305-318.

［32］ Liu Y，Liu T，F(xiàn)an X，et al.Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood in rotating wall vessel［J］.J Biotechnol，2006，124(3):592-601.