茍小蘭 ，王 利 *，侯顯耀 ，龍鐘明 ，魏 勇 ，黃文明

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637600；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

本試驗(yàn)觀測(cè)了成都某丁鮭魚養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)病魚主要表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、體表鱗片大面積脫落、體表局部充血等癥狀，剖檢可見主要臟器已發(fā)生不同程度病變。從病魚體內(nèi)分離得到了一株細(xì)菌，采用細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)方法、16S rDNA序列擴(kuò)增分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定和生物學(xué)特性研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 試驗(yàn)魚來源于成都某丁鮭魚養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)6.0cm，體重15.0g。

1.2 主要儀器及試劑 PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；生化鑒定藥品均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，麥康凱瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)），營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生 產(chǎn)），TaqMix、DNA Marker DL2000， 購(gòu) 自 Tiangen Biotech（Beijing）。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌操作下分別挑取丁鮭魚腎臟、肝臟、心臟組織于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，選取形態(tài)均一的優(yōu)勢(shì)菌群，挑取單菌落反復(fù)劃線純化，純化所得菌株于4℃保存。再將保存菌株劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 生理生化鑒定 將純培養(yǎng)菌株穿刺接種于細(xì)菌生化特性鑒定管中，參照生化反應(yīng)管使用說明書，對(duì)分離純化培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

1.5 16S rDNA基因的擴(kuò)增和測(cè)序 挑取單個(gè)菌落于滅菌水中，-80℃凍存1h后，立即置于100℃沸水浴20min，然后4℃ 12000r/min離心5min，取上清液作為PCR模板。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物：上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′，下游引物 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。50μL反應(yīng)體系中含有：模板4μL，上游引物、下游引物各2μL（引物濃度均為 10 μmol/L），Taq Mix 25 μL，ddH2O 19μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃ 30s、60℃30s、72℃ 4min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃4min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 4min，30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將陽(yáng)性樣品送交北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用Blastn系統(tǒng)對(duì)分離菌株的16S rDNA序列與GenBank中的相關(guān)親近物種進(jìn)行同源性檢索，找出相似性最高的菌株及同屬菌株作為內(nèi)群，另選取弧菌（Vibrio）作外群。運(yùn)用ClustalX2.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再用MEGA5.0軟件包中的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Kimura 2-parameter作為校正模型，自舉1000次（Boostrap）進(jìn)行置信度檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 從被檢丁鮭魚的腎臟、肝臟、心臟組織分離純化培養(yǎng)得到形態(tài)均一的細(xì)菌，該菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，其表面略有菌膜。在麥康凱培養(yǎng)基上經(jīng)28℃培養(yǎng)20h后，菌落呈現(xiàn)出表面光滑濕潤(rùn)、圓形、向上隆起、邊緣整齊、乳白色。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上可觀察到灰白色半透明濕潤(rùn)菌落。革蘭氏鏡檢表明，該菌為革蘭氏陰性桿菌，菌體呈兩端鈍圓，多單個(gè)或兩兩并排存在。

2.2 生理生化鑒定 菌株XN602具動(dòng)力性；不發(fā)酵鼠李糖、側(cè)金盞花醇、山梨醇等；H2S、尿素、蛋白胨水呈陰性；β-半乳糖苷酶、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽等呈陽(yáng)性，其他生理生化特性見表1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，初步判定該菌株為維氏氣單胞菌。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rDNA基因擴(kuò)增 以菌株XN602為模板，對(duì)其16S rDNA通用引物進(jìn)行體外擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最終擴(kuò)增出長(zhǎng)度大小約為1500bp的PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。經(jīng)由六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，得到實(shí)為1468bp大小的PCR產(chǎn)物片段，將此序列提交至GenBank（登錄號(hào)為JQ013893）Blastn程序比對(duì)分析，顯示菌株XN602的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中維氏氣單胞菌分離株的相似性最高達(dá)99%。

圖1 菌株XN602 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 選取相似度較高的同種菌株及相關(guān)同屬菌株運(yùn)用ClustalX2.0與MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。分離菌株的Bootstrap自舉檢驗(yàn)值達(dá)1000次，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出分離細(xì)菌XN602（圖中用“●”標(biāo)注）與氣單胞菌屬聚為一個(gè)類群，且與維氏氣單胞菌聚為一個(gè)分支，明顯同弧菌屬分開，由此可推斷此次分離得到的細(xì)菌為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

圖2 菌株XN602 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

3.1 維氏氣單胞菌又被稱為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維隆氣單胞菌，該菌為近年來發(fā)現(xiàn)鑒定的一個(gè)新種氣單胞菌。已知維氏氣單胞菌普遍存在于各種水體、淤泥等環(huán)境中，廣泛分布于世界各地。其中一部分菌株在微生態(tài)環(huán)境中能正常存在，而另一部分菌株如嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等則具有強(qiáng)的致病性，可引起水產(chǎn)動(dòng)物的大量死亡。已有報(bào)道證實(shí)維氏氣單胞菌是感染鯰魚、西伯利亞鱘、中華絨鰲蟹、鏡框鯉、錦鯉、斑點(diǎn)叉尾鮰等的主要細(xì)菌之一。最近有研究表明該類菌可感染人體，通常引起患者發(fā)生急性腹瀉，也可引起菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等疾?。灰灿袌?bào)道稱維氏氣單胞菌能引起人類肺炎。眾多實(shí)驗(yàn)及病例表明維氏氣單胞菌已成為一種人魚共患的致病菌，已對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康逐漸構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

3.2 從患病丁鮭魚中分離得到了菌株XN602，根據(jù)對(duì)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性等鑒定初步確定為維氏氣單胞菌，但菌株XN602又與維氏氣單胞菌的模式菌株存在一定差異，如鳥氨酸呈陽(yáng)性、精氨酸呈陰性等，因而不能對(duì)分離菌進(jìn)行準(zhǔn)確的判定。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，科研工作者將基于16S rRNA的分析方法引入到原核生物分子層次的鑒定后，該方法已逐步得到完善。目前，16S rDNA序列分析已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的鑒定中，進(jìn)一步提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性與高效性。本試驗(yàn)采用一對(duì)通用引物擴(kuò)增出了菌株XN602的16S rDNA片段,并對(duì)其序列進(jìn)行了分析，將所獲得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的微生物16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，得出該菌與維氏氣單胞菌的同源性高達(dá)99%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上該菌株顯示與其他維氏氣單胞菌聚為一簇，從分子生物學(xué)水平上鑒定了分離菌株XN602為維氏氣單胞菌。

3.3 本試驗(yàn)中，根據(jù)細(xì)菌表型特征、生理生化鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)果，可判定菌株XN602是維氏氣單胞菌。而進(jìn)化樹上每個(gè)聚群內(nèi)部之間的遺傳距離很相近，反應(yīng)了其親緣關(guān)系較近，但又有差別，這在一定程度上表明了相同菌種在不同物種、不同環(huán)境間又具有一定的差異性。16S rDNA分子鑒定具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于相近種的區(qū)分也有一定的困難；另外，GenBank中16S rDNA基因序列的數(shù)量也有限，而且未經(jīng)過嚴(yán)格的篩選及檢驗(yàn)，序列的正確與否也可能限制16S rDNA鑒定方法的準(zhǔn)確性。綜上所述，在魚類細(xì)菌的分類鑒定中最好采用多種方法，從不同的研究水平和層次描述細(xì)菌的不同特征，從而提高鑒定菌株的準(zhǔn)確性。

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