岳建偉， 汪 蘋， 張艷萍， 酒衛(wèi)敬

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

水處理中特種菌株的包埋與保存方法研究

岳建偉， 汪 蘋， 張艷萍， 酒衛(wèi)敬

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

采用聚乙烯醇-硼酸法對WXZ-2、WXZ-8兩株菌進(jìn)行了包埋固定化，通過正交試驗優(yōu)選出較佳包埋條件，即包菌量4%、PVA質(zhì)量濃度5%、交聯(lián)時間12 h、小球直徑2.5 mm．通過對冷凍干燥，40℃干燥兩種保存方式下小球的外觀表現(xiàn)、機械強度、微生物活性以及吸附性的測試與比較得出，40℃干燥保存的包埋小球有著更好的活性、機械強度與吸附性能，是一種更理想的干燥保存方式．

包埋固定化;異養(yǎng)硝化;好氧反硝化;正交試驗;干燥保存

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的存在，突破了傳統(tǒng)的理論認(rèn)識，簡化了廢水處理過程［1－5］．如今，利用硝化-好氧反硝化來實現(xiàn)含氮廢水的高效脫氮已成為國內(nèi)外研究的熱點．

水處理高效菌株篩選出以后，受到運輸和保存條件的限制，難以廣泛使用，固定化微生物技術(shù)可以很好地解決這一問題．黃川［6］等用海藻酸鈉固定化活性污泥制成顆粒小球，以流化床反應(yīng)器對甲醇廢水進(jìn)行處理．在一定條件下，當(dāng)進(jìn)水COD＜722.2 mg/L，進(jìn)水甲醇質(zhì)量濃度＜307.4 mg/L時，對COD的去除率大于85%，對甲醇的去除率可達(dá)到90%左右．耿振香［7］等采用PVA-H3BO3包埋固定化活性污泥中篩選的硝化菌和反硝化菌，對生活污水進(jìn)行硝化反硝化工藝處理，當(dāng)廢水中氨氮質(zhì)量濃度為45 mg/L．pH值為7.5，DO為2.0 mg/L，水力停留時間為18 h，氨氮去除率可達(dá)96%．Furukawa K，Kazuichi Isaka，張爽［8－10］等眾多學(xué)者在固定化硝化細(xì)菌對硝化效率的提高方面進(jìn)行了一定的研究．馮雅男等［11］對將硝化菌和反硝化菌混合包埋實現(xiàn)同時硝化反硝化的生物脫氮技術(shù)進(jìn)行了研究．王磊［12］等對固定化異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的脫氮能力進(jìn)行了研究，優(yōu)選出理想的包埋材料．酒衛(wèi)敬［13］等對海藻酸鈉做包埋劑固定化異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌WXZ-8進(jìn)行了研究，優(yōu)選出了較佳包埋條件．固定化微生物技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于廢水處理，并取得了一定成果，但目前對固定化產(chǎn)品保存的研究很少．

本研究選擇能對食品發(fā)酵廢水的脫氮處理有特效的異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌進(jìn)行包埋固定化，并采用正交試驗選出較佳包埋條件，對冷凍干燥和40℃干燥處理后包埋小球的性能進(jìn)行對照和比較．

1 實驗材料與方法

1.1 材料與菌種

藥品:聚乙烯醇(PVA)、瓊脂粉、硼酸、無水氯化鈣均為分析純．海藻酸鈉(SA)為化學(xué)純．

實驗菌株屬性如表1．

兩株菌株均為實驗室自己篩選的，通過鑒定證明具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能．

1.2 菌種培養(yǎng)基

異養(yǎng)硝化富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.47 g/L，KH2PO41 g/L，F(xiàn)eCl2·6H2O 1.25 g/L，CaCl2·7H2O 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，碳源用量依據(jù)正交試驗設(shè)計COD/N調(diào)節(jié)．

表1 菌株屬性［14］Tab．1 Strains attributes list

異養(yǎng)硝化測定培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.47 g/L，維氏鹽溶液50 mL，碳源用量依正交試驗設(shè)計COD/N及碳源種類調(diào)節(jié)．

維氏鹽溶液:K2HPO45.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，NaCl 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L．

1.3 實驗方法

1.3.1 包埋方法

聚乙烯醇(PVA)-H3BO3包埋法:配置定量PVA+2%瓊脂+0.1%海藻酸鈉(SA)(PVA為主要包埋劑，瓊脂與海藻酸鈉為添加劑)混合液，加熱使其充分混勻．并配置4%硼酸+2%氯化鈣的交聯(lián)液，將混合液與交聯(lián)液一起放入滅菌鍋中在121℃下滅菌20 min，后取出，放進(jìn)無菌操作臺．

稱取一定質(zhì)量離心后(8 000 r/min，5 min)的目標(biāo)菌，在滅過菌的燒杯中加少量蒸餾水混均，然后加入PVA混合液中搖勻，用5 mL移液槍滴入降至室溫的交聯(lián)液中成球，再放入4℃恒溫冰箱內(nèi)交聯(lián)適當(dāng)時間，取出用蒸餾水沖洗，保存．

1.3.2 干燥方法

1)冷凍干燥．將小球轉(zhuǎn)移到滅過菌的空培養(yǎng)皿中，用封口膜封住，膜上扎孔透氣，放進(jìn)冷凍干燥器中連續(xù)冷凍干燥24 h，然后取出倒入自封袋中，在4℃恒溫冰箱內(nèi)保存．

2)40℃干燥．將小球轉(zhuǎn)移到滅過菌的空培養(yǎng)皿中，放入烘箱中，在40℃下連續(xù)干燥36 h，然后取出倒入自封袋中，在4℃恒溫冰箱內(nèi)保存．

1.3.3 包埋小球活性的測定

以氨氮和總氮的去除率來反應(yīng)包埋小球的活性．按照1.3.1中聚乙烯醇包埋法制作包埋小球，按照1.2配置異養(yǎng)硝化測定培養(yǎng)基，調(diào)至最適pH值，用量筒量取200 mL分裝到250 mL錐形瓶中，在121℃下滅菌20 min空冷至室溫．然后稱取10 g濕小球，放入培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩器中連續(xù)培養(yǎng)4 d，每24 h取樣一次，離心后取上清液測定NH+4-N和TN的濃度，與空白樣比較并分別計算二者的去除率，理論上，去除率隨時間的延長而增大，達(dá)到一定值后便保持穩(wěn)定不再發(fā)生變化，因此取其最大值為測定結(jié)果．

測定液中無有機氮，故濃度 ρ(TN)=ρ(NH+4-N)+ρ(NO－3-N)+ρ(NO－2-N)．測定方法［15］:

1)NH+4-N:納氏試劑分光光度法;

2)NO－3-N:紫外分光光度法;

3)NO－2-N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法.

1.3.4 機械強度測定

1)抗壓強度．用brook field CT3-4500型質(zhì)構(gòu)儀測定．測試速度:0.5 mm/s，壓縮率:4%，探頭:TA 11/1000(圓柱形，直徑=25.4 mm)．

2)剪切強度［16］．將60個小球放入250 mL錐形瓶，加入200 mL去離子水，在恒溫振蕩器上220 r/min振蕩15 h，完好的小球與原小球總數(shù)的比表示小球的強度系數(shù)．

1.3.5 吸附性能［17］

將定量凝膠小球放入稀釋的墨水中，恒溫24 h后取出.采用美國VARIAN CARY-50型紫外-可見分光光度計掃描測試墨水溶液在波段450～700 nm的透過率，以此反映包埋小球吸附性能．

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果分析

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［13，18］，并結(jié)合小球?qū)嶋H制作經(jīng)驗，擬考察4個因素:A包菌量、B PVA濃度、C交聯(lián)時間、D小球直徑，各因素的水平取值如表2．以和TN的去除率為試驗指標(biāo)．

表2 正交試驗因素水平表Tab．2 Factor levels of orthogonal tests

按照1.3.3測定包埋菌株的活性，搖床培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速為180 r/min、COD/N為25、初始pH值為8，溫度為30℃．氮源為硝酸鉀和硫酸銨，初始質(zhì)量濃度約為ρ(NO3-N)=10 mg/L和ρ(NH4+-N)=100 mg/L，碳源為檸檬酸三鈉［19］．結(jié)果見表3.

表3 WXZ-2 PVA正交試驗分析結(jié)果Tab．3 Result analysis of orthogonal tests on PVA of WXZ-2

由正交試驗結(jié)果可知:

1)氨氮和總氮的分析結(jié)果比較一致，實驗5的去除效果最好．

2)各因素理論較優(yōu)水平為:A2B3C3D1，即:包菌量為4%，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，交聯(lián)時間為12 h，小球直徑為2.5 mm．

3)由極差大小可以看出影響氨氮和總氮處理效果的各因素作用的順序是:小球直徑＞加菌量＞PVA濃度＞交聯(lián)時間．

從結(jié)果可以看出，小球直徑是處理效果的主要影響因素，小球直徑太小，滴制時槍頭易發(fā)生堵塞，不利于小球制作，因此小球直徑最小定為2.5 mm．PVA濃度為第三影響因素，PVA濃度不宜太高，濃度太高導(dǎo)致小球制作中拖尾嚴(yán)重，易粘連，成球性不好．交聯(lián)時間對處理效果也有一定的影響，故補充單因素實驗，結(jié)果如圖1．

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig．1 Experiment results on single factor

由圖1分析，氨氮和總氮去除率隨著交聯(lián)時間的延長而增高．但達(dá)到一定水平后，去除率趨于平緩，甚至呈下降趨勢．這是因為交聯(lián)時間越長，小球表面越致密，其傳質(zhì)阻力就會越大，通透性越差，同時硼酸對細(xì)胞有一定毒性，交聯(lián)時間過長會影響菌株的活性．因此，12 h是一個比較理想的交聯(lián)時間．

最終確定WXZ-2的較佳包埋條件是:包菌量為4%、PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、交聯(lián)時間為12 h、小球直徑為2.5 mm．

同樣的方法，對WXZ-8菌進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出較佳包埋條件也是:加菌量為4%、PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、交聯(lián)時間為12 h、小球直徑為2.5 mm．

對比游離菌與包埋菌的菌株活性，結(jié)果見表4．包埋菌株的脫氮性能與其游離菌相比沒有明顯降低，說明此方法比較適合兩株菌的固定化．

表4 包埋菌與游離菌活性對比Tab．4 Activity contrast between entrapped and free bacteria %

2.2 保存方法的研究

通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對小球保存進(jìn)行研究的很少，一種好的保存方法可以有效保持菌株的活性［12，20］，而干燥保存比蒸餾水浸泡、生理鹽水浸泡等保存方式，更方便小球的運輸與應(yīng)用，下邊對冷凍干燥與40℃干燥兩種不同保存方式進(jìn)行對照分析．

在較優(yōu)包埋條件下分別制作大量WXZ-2和WXZ-8兩種菌株的包埋小球，分成兩批，一批進(jìn)行冷凍干燥，一批進(jìn)行40℃干燥，待用．

2.2.1 保存時間

按照1.3.3測定包埋菌株的活性，每隔7 d測定一次，研究包埋固定化菌株WXZ-2和WXZ-8的活性隨保存時間的變化，實驗結(jié)果如圖2．

從圖中可以看出，經(jīng)過1個月的保存，40℃干燥保存的包埋小球比冷凍干燥保存的小球具有較好的氨氮和總氮去除率，但相差不多，僅有1% ～5%，經(jīng)過1個月后，包埋小球的氨氮和總氮去除率均維持在90%左右，沒有明顯降低，由此看來，兩種方式均對兩株菌起到了很好的保存作用．

2.2.2 外觀對照

兩種干燥條件下，小球外觀圖片見圖3．冷凍干燥小球的表面光滑，有光澤，個體分開．40℃干燥小球發(fā)暗，部分易粘附在一起．前者比后者有更好的外觀表現(xiàn)．

圖2 氨氮和總氮的去除率Fig．2 Removal rate of NH4+-N and TN

圖3 小球外觀圖Fig．3 Appearance of the balls

2.2.3 機械強度

1)抗壓強度測試結(jié)果．使用質(zhì)構(gòu)儀按照1.3.4中的測試條件進(jìn)行測試，結(jié)果如表5．

表5 硬度測試結(jié)果Tab．5 Results of hardness testing

2)剪切強度測試結(jié)果．按照1.3.4中的方法進(jìn)行測試，小球破碎率如表6．

表6 破碎率測試結(jié)果Tab．6 Results of breakage rate

從對強度的測試結(jié)果來看，40℃干燥后的小球的抗壓力和抗剪切力的強度都要大于冷凍干燥的小球，這就有利于小球在運輸過程中不被壓碎，同時也有利于小球在反應(yīng)器中較好的保持形態(tài)．如果對機械強度要求不是太高的情況下，兩種干燥方式基本都能滿足．

2.2.4 吸附性能測試結(jié)果

按照1.3.5的方法進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖4．干燥去除包埋小球表面與內(nèi)部的水分，干燥方式不同，處理后小球的表面積不同，而表面積直接影響到小球的吸附性，較好的吸附性可以使包埋小球在水處理中獲得更好的效果．由圖4中可以看出，WXZ-8，WXZ-2在40℃條件下干燥保存的小球比冷凍干燥保存小球的吸附性能要好．

圖4 包埋小球在干燥保存后的紫外光譜Fig．4 UV spectrums of embedding balls after drying

3 結(jié)論

1)優(yōu)選出了WXZ-2，WXZ-8兩株好氧反硝化菌的較佳包埋條件，即包菌量為4%、PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、交聯(lián)時間為12 h、小球直徑為2.5 mm．包埋后的菌株NH+4-N、TN去除率都在90%以上，與游離菌相比降低很少．

2)通過對比冷凍干燥與40℃干燥，得出40℃干燥的包埋小球具有更高的活性，更大的硬度和更好的吸附性能，因此，對WXZ-2和WXZ-8而言，40℃干燥是一種更理想的保存方式．

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Study on Entrapped Immobilization and Preservation of Heterophic Nitrification Aerobic Denitrifying Bacteria

YUE Jian-wei， WANG Ping， ZHANG Yan-ping， JIU Wei-jing
(School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Two heterotrophic nitrification aerobic denitrifying bacteria strains，WXZ-2 and WXZ-8，were immobilized by PVA-boric acid method．The optimal embedding conditions were obtained by orthogonal test method．The Quantity of entrapped bacteria was 4%．The concentration of PVA was 5%．The crosslinking time was 12 h．And the diameter of the immobilized beads was 2.5 mm．Two different drying methods，freeze-drying and drying at 40℃，were compared to keep the beads．It was proved that the beads dried at 40℃ showed much better activity，mechanical strength and adsorption performance．

entrapped immobilization;heterotrophic nitrification;aerobic denitrification;orthogonal test;preservation after drying

TS208;X792

A

1671-1513(2012)01-0051-06

2011-06-08

岳建偉，男，碩士研究生，研究方向為水污染控制;

汪 蘋，女，教授，主要從事水污染控制方面的研究．通訊作者．