林曉姿， 梁璋成， 何志剛， 李維新， 任香蕓

(1．福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003;2．福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，福建福州 350013)

兩株自選乳酸菌的益生特性

林曉姿1，2， 梁璋成1，2， 何志剛1，2， 李維新1，2， 任香蕓1，2

(1．福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003;2．福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，福建福州 350013)

研究了兩株自選乳酸菌的益生特性，為其應(yīng)用于果蔬汁乳酸發(fā)酵的功能性飲料研制提供理論依據(jù)．以自選植物乳桿菌R23和干酪乳桿菌R35為目標菌，以德氏乳桿菌保加利亞亞種6045為對照菌，考察各菌對模擬胃液酸度和腸道膽鹽的抗逆性以及凝集能力、表面疏水性等黏附性能，并評價其發(fā)酵液對超氧陰離子和羥基自由基的清除能力等體外抗氧化功能．結(jié)果表明:兩菌株對酸度和膽鹽的耐受能力均優(yōu)于對照菌，植物乳桿菌R23的抗逆性最強，能耐受pH值2.5、膽鹽質(zhì)量濃度5 g·L－1．干酪乳桿菌R35的黏附能力強，而植物乳桿菌R23疏水性較強而凝集能力較弱．各菌株的胞外代謝產(chǎn)物均有抗氧化能力，以植物乳桿菌R23為最強，其培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率達77.8%和80.94%，分別比對照菌高36.72%和5.81%．

植物乳桿菌;干酪乳桿菌;益生特性;抗氧化

歐洲食品和飼料菌種協(xié)會(European food and feed cultures association，EFFCA)于2002年給益生菌作出最新定義:益生菌(probiotics)是活的微生物，攝入充足的數(shù)量后，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且經(jīng)論證的健康益處，如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，顯著降低血清膽固醇和低密度脂蛋白含量，提高人體抗氧化能力，維持腸道內(nèi)菌群平衡，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等［1－3］．我國國家衛(wèi)生部2010年4月印發(fā)的《可用于食品的菌種名單》，包含了雙歧桿菌屬6種，乳桿菌屬14種，鏈球菌屬1種，丙酸桿菌屬1種，乳酸乳球菌屬3個亞屬，均屬于益生菌．植物乳桿菌與干酪乳桿菌是兩種較為常用的潛在益生菌［4］．本實驗室篩選出的適合果蔬全汁乳酸發(fā)酵的植物乳桿菌R23和干酪乳桿菌R35［5］，是兩株植物源乳酸菌．益生菌要在人體內(nèi)發(fā)揮其獨特的功能，就必須對宿主的胃腸環(huán)境具有理想的抗逆性，能夠耐受胃液、腸液和膽汁的脅迫．并且具有較強的腸道定植力，在腸道內(nèi)維持一定數(shù)量級的活菌數(shù)．益生菌株通過自凝集作用集合到一定數(shù)量使菌株發(fā)揮益生功效［6］，并形成多細胞簇以阻礙致病菌定植和感染［7］，因此，乳酸菌對腸黏膜上皮細胞的黏附能力是其作為益生菌菌株的前提，與同菌種(自凝集)或與不同菌株的凝集作用(交互凝集)及菌體表面疏水特性通常被認為是兩個獨立的、能反應(yīng)乳酸菌黏附能力的特征［8］．

目前對乳酸菌抗氧化能力的研究多集中在對活菌細胞或超聲波破碎活菌細胞后離心得到的無細胞抽提液(胞內(nèi)代謝產(chǎn)物)的抗氧化能力上，尚未見有關(guān)乳酸菌發(fā)酵液(胞外代謝產(chǎn)物)抗氧化能力的研究報道．本研究考察了乳酸菌發(fā)酵液耐受酸度和膽鹽能力、黏附性能，評價了無菌發(fā)酵液的體外抗氧化能力，為乳酸菌活體細胞及其代謝產(chǎn)物的高效利用，研發(fā)具有益生功能的食品提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 供試菌株

植物乳桿菌R23(lactobacillus plantarum R23)、干酪乳桿菌R35(lactobacillus casei R35)，福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心選育并保存［9］．

德氏乳桿菌保加利亞亞種6045(下簡稱6045)、大腸桿菌，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心．

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LH18 培養(yǎng)基［10］

用于乳酸菌液體培養(yǎng)．

1.2.2 細菌培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水補足1 L，pH 值7.0±0.1，1×105Pa下滅菌20 min．用于指示菌(大腸桿菌)液體培養(yǎng)．

1.2.3 TJA培養(yǎng)基

番茄汁50 mL，酵母抽提液5 g，牛肉膏10 g，乳糖 20 g，葡萄糖 2 g，磷酸氫二鉀 2 g，吐溫 80 1 g，乙酸鈉5 g，加蒸餾水至1 L，pH 值6.8 ±0.2，1 ×105Pa滅菌20 min．用于細胞活菌計數(shù)．

1.3 種子液制備

將乳酸菌株接入LH18培養(yǎng)基，25℃控溫培養(yǎng)24 h，菌體生物量達109CFU/mL以上，將發(fā)酵液在3 000 r/min、4℃離心10 min，收集菌坭，備用．大腸桿菌(指示菌)在細菌培養(yǎng)基中25℃控溫培養(yǎng)24 h，菌體生物量達107CFU/mL以上，將培養(yǎng)液3 000 r/min、4℃離心10 min收集菌坭，備用．

1.4 耐酸及耐膽鹽實驗

收集的乳酸菌菌坭用無菌生理鹽水洗滌2次，并以原體積的十分之一制成懸浮菌，以1%的接種量分別接種于 pH 值為 3.5，3.0，2.5，2.0，1.5 和膽鹽質(zhì)量濃度為 0，1，3，5 g·L－1的 LH18 培養(yǎng)基中，25℃控溫培養(yǎng)4 h，每2 h取樣進行活菌計數(shù)，平行3次取平均值．

1.5 體外黏附能力實驗

1.5.1 菌體處理

將收集的乳酸菌和大腸桿菌菌坭分別用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.0)洗滌2次，制成在波長600 nm處的吸光度值為0.4±0.1的懸浮菌液．

1.5.2 自凝集能力［11］

吸取各乳酸菌懸液4 mL加入試管中，于25℃靜置培養(yǎng)24 h，測定各菌懸液在波長600 nm處的吸光值．自凝集率公式:

式(1)中，A0和A24分別為菌懸液在0 h和24 h的吸光值．

1.5.3 交互凝集能力［11］

吸取各乳酸菌菌懸液2 mL和大腸桿菌菌懸液2 mL混合，振蕩30 s，于25℃靜置培養(yǎng)24 h，測定混合菌懸液在波長600 nm處的吸光值．交互凝集率公式:

式(2)中，A0和A24分別為混合菌懸液0 h及靜置24 h后的吸光值．

1.5.4 表面疏水性

采用菌體對碳氫化合物的黏附法(adherence of bacteria to hydrocarbons，BATH)［12］，即菌體對碳氫化合物的黏附測定．將各乳酸菌菌坭分別用PBS制成在560 nm處的吸光值為0.6±0.1的懸浮菌液，吸取5 mL與1 mL二甲苯渦旋混合30 s，25℃下靜置20 min，取下層水相在波長560 nm處測量吸光度值，以PBS為參比液．表面疏水率:

式(3)中，A0和At分別是與二甲苯混勻前、后的菌液在560 nm處的吸光值．

1.6 無細胞發(fā)酵液的抗氧化能力測定

1.6.1 發(fā)酵液制備

將乳酸菌以107CFU/mL的接種量接入LH18培養(yǎng)基中，將25℃控溫發(fā)酵24 h的發(fā)酵液在4 800 r/min、4℃離心10 min，收集上清液，即為無細胞發(fā)酵液．

1.6.2 抗氧化能力的陽性對照標準曲線的繪制

以不同質(zhì)量濃度(0.05～0.25 mg/mL)的Vc作為陽性對照，測定其對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率．Vc添加量對超氧陰離子自由基及羥基自由基清除率符合方程y=2.831 5x+0.111 2(R2=0.992 1)和y=0.6677x－0.0086(R2=0.9933)，兩曲線均為線性相關(guān)﹙見圖1﹚．

圖1 Vc標準曲線Fig．1 Standard curve of Vc

1.6.3 超氧陰離子自由基清除率的檢測［13－14］

采用鄰苯三酚自氧化法測定發(fā)酵液對超氧自由基的清除率．按照表1中配制溶液A00、空白溶液A0、樣品空白溶液A'0和樣品測定溶液Ax，于25℃水浴中保持5 min，而后迅速加入1 mL 8 mol/L HCl中止反應(yīng)，測定吸光值．分別以不加乳酸菌的培養(yǎng)基LH18、0.2 mg/mL的Vc溶液為對照．超氧陰離子自由基清除率(%)=［A0－(Ax－A'0)］/A0×100%．

表1 超氧陰離子自由基清除率分析加樣表Tab．1 Samples table of superoxide radical scavenging mL

1.6.4 羥基自由基清除率的檢測［13－14］

采用Fenton反應(yīng)法測定發(fā)酵液對羥基自由基的清除率．按照表2配制溶液A00、空白溶液A0、樣品空白溶液A'0和樣品測定溶液Ax，于37℃水浴中保持1 h，測定吸光度．分別以不加乳酸菌的培養(yǎng)基LH18、0.2 mg/mL的Vc溶液為對照．羥基自由基清除率/%=［A0－(Ax－A'0)］/A0×100%．

1.7 統(tǒng)計分析

采用DPS軟件進行顯著性分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，結(jié)果以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著．

表2 羥自由基清除率分析加樣表Tab．2 Samples table of hydroxy radical scavenging mL

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株的耐酸及耐膽鹽能力

各菌株在不同pH值及膽鹽濃度環(huán)境中培養(yǎng)4 h后的菌量變化見表3、表4．植物乳桿菌R23在pH值2.5環(huán)境下培養(yǎng)4 h的生物量仍達106CFU/mL，干酪乳桿菌R35可耐受pH值3.0的酸度，但在pH值2.5和2.0條件下培養(yǎng)4 h和2 h均已死亡;植物乳桿菌R23可耐受5 g·L－1膽鹽，培養(yǎng)4 h后的生物量仍可達107CFU/mL，干酪乳桿菌 R35可耐受0.3%膽鹽濃度．結(jié)果表明，植物乳桿菌R23具有較強的抗逆性能，能在pH 2.5，膽鹽濃度0.5%的條件下維持生長．

表3 耐酸能力試驗結(jié)果Tab．3 Results of acid resistance lg(CFU/mL)

表4 耐膽鹽能力試驗結(jié)果Tab．4 Results of bile tolerance lg(CFU/mL)

2.2 各菌株的黏附能力

各菌株凝集特性試驗結(jié)果，見圖2．結(jié)果表明，干酪乳桿菌R35的自凝集和對大腸桿菌的交互凝集率最高，分別達48.17%，24.31%，比植物乳桿菌和6045高15.50%，9.35%和11.89%，6.12%，菌株間的差異均達極顯著水平(P＜0.01);菌株的自凝集能力與其交互凝集能力呈正相關(guān)．各菌株表面疏水性試驗結(jié)果，見圖3．結(jié)果表明，干酪乳桿菌R35的表面疏水性最高，達20.75%，分別比植物乳桿菌R23和6045高3.41%和4.51%，菌株間的差異均達極顯著水平(P＜0.01)．菌株的凝集能力及表面疏水性越高，則菌株的黏附能力也高．實驗表明:干酪乳桿菌R35具有較高的凝集能力和表面疏水性，黏附能力最強．植物乳桿菌R23與對照菌比，凝集能力弱，疏水性強．

圖2 凝集特性Fig．2 Aggregation properties

圖3 表面疏水性Fig．3 Cell-surface hydrophobicity

2.3 各菌株的抗氧化能力

各菌株的無菌發(fā)酵液對超氧陰離子和羥自由基均有一定的清除能力﹙見圖4﹚，與培養(yǎng)基的差異均達極顯著(P＜0.01)，說明各菌株的胞外代謝產(chǎn)物均有抗氧化能力，尤其是清除超氧陰離子自由基的能力．其中，以植物乳桿菌R23發(fā)酵液的清除自由基能力最強，發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別達到77.8%和80.94%，比對照菌6045高36.72%和5.81%，Vc相當量為0.231 mg/mL和0.167 mg/mL．干酪乳桿菌R35的清除羥自由基的能力比對照菌6045略強而清除超氧自由基的能力比對照菌6045弱．

圖4 抗氧化能力Fig．4 Oxidation resistance

3 結(jié)論與討論

1)乳酸菌要發(fā)揮益生作用就必須通過胃部和腸道，而胃液的強酸性和腸道的膽鹽可以殺死隨食物進入胃內(nèi)的細菌，因此，具有益生性的乳酸菌必須有耐受強酸及膽鹽的能力，才能保證有足夠生物量通過消化道環(huán)境的脅迫，進入宿主腸道發(fā)揮益生功效．植物乳桿菌R23及干酪乳桿菌R35是本實驗室從自然發(fā)酵的枇杷酒酒醪中分離選育而得的兩株植物源乳酸菌，耐受總SO2質(zhì)量濃度達120 mg/L，具有蘋果酸乳酸代謝能力［9］，表現(xiàn)出較強的抗逆性，這可能與植物源乳酸菌的細胞壁等外部結(jié)構(gòu)較為堅韌復雜有關(guān)，其機理有待進一步研究．

2)含活菌的乳酸發(fā)酵制品具有抗氧化作用，是因為乳酸菌代謝過程能產(chǎn)生一些抗氧化酶類物質(zhì)［15］，或者乳酸菌體內(nèi)存在天然的抗氧化劑使乳酸菌菌體自溶后能產(chǎn)生抗氧化活性［16］，有的乳酸菌存在一種基于細胞內(nèi)Mn2+積聚的非酶歧化系統(tǒng)，能夠清除超氧自由基［17］，有些乳酸菌通過控制轉(zhuǎn)運鐵離子的吸收和儲存來防御細胞的氧化損傷［18］．本實驗結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵后的無菌發(fā)酵液即胞外代謝產(chǎn)物，也有較強的抗氧化能力，尤其是清除超氧陰離子自由基的能力，說明非活菌的乳酸發(fā)酵制品也具有清除自由基等抗氧化益生功能．

3)實驗結(jié)果表明，植物乳桿菌R23可耐受pH值2.5、膽鹽質(zhì)量濃度 5 g·L－1，對消化道環(huán)境的耐受能力強，還具有較強的黏附能力，其發(fā)酵液清除超氧陰離子自由基和羥自由基的抗氧化功能理想．因此，植物乳桿菌R23是開發(fā)益生功能的乳酸發(fā)酵飲料的優(yōu)良菌株．干酪乳桿菌R35雖然具有較強的黏附能力及抗氧化性，但其耐受強酸及膽鹽的能力較植物乳桿菌R23差．

4)凝集能力、表面疏水性等黏附性能是菌株重要的特性之一，彼此間具有相關(guān)性．菌株的自凝集能力與其交互凝集能力呈正相關(guān)，菌株的凝集能力及表面疏水性越高，這與劉勇、王麗群［19－20］等人的研究結(jié)果一致．

［1］曾東，唐雨蕊，倪學勤，等．植物乳桿菌F22對肝臟和腸道微生物菌群的影響研究［J］．營養(yǎng)學報，2010，32(4):370-374．

［2］Guo Z，Wang J C，Yan L Y，et al．In vitro comparation of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang，a potential new probiotic，with selected probiotic strains［J］．LWT-Food Science and Technology，2009，42:1640-1646．

［3］de Vries M，Vaughan E E，Kleerebezem M，et al．Lactobacillus plantarum-survival，functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract［J］．International Dairy Journal，2006，16(9):1018-1028．

［4］方立超，魏泓．益生菌的研究進展［J］．中國生物制品學雜志，2007，20(6):463-466．

［5］林曉姿，梁璋成，何志剛，等．枇杷汁乳酸發(fā)酵優(yōu)良菌株篩選及其發(fā)酵特性研究［J］．熱帶作物學報，2011，32(3):1-7．

［6］Collado M C，Meriluoto J，Salminen S．Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains［J］．European Food Research and Technology，2008，226:1065-1073．

［7］Schachtsiek M，Hammes W P，Hertel C．Characterization of Lactobacillus coryniformis DSM 20001T surface protein mediating coaggregation with and aggregation among pathogens［J］．Applied and Environmental Microbiology，2004，70(12):7078-7085．

［8］Vlková E，Rada V，Smehilová M，et al．Autoaggregation and co-aggregation ability in bifidobacteria and clostridia［J］．Folia Microbiologica，2008，53(3):263-269．

［9］何志剛，任香蕓，李維新，等．枇杷酒中蘋果酸乳酸發(fā)酵優(yōu)良乳酸菌的分離與鑒定［J］．中國食品學報，2011，11(1):165-171．

［10］梁璋成，何志剛，任香蕓，等．MLF植物乳桿菌R23培養(yǎng)基優(yōu)化［J］．福建農(nóng)業(yè)學報，2009，24(6):570-574．

［11］Collado M C，Meriluoto J，Salminen S．Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains［J］．European Food Research and Technology，2008，226(5):1065-1073．

［12］Rosenberg M，Gutnick D，Rosenberg E．Adherence of bacteria to hydrocarbons:A simple method for measuring cell-surface hydrophobicity［J］．FEMS Microbiology Letters，1980，9(1):29-33．

［13］劉利娥，張浩勤，劉金盾，等．芝麻葉多糖的提取及抗氧化活性研究［J］．中國食品學報，2010，10(5):160-165．

［14］蔣超，陸軍，林莉莉，等．紅薯莖葉提取物抗氧化性的研究［J］．中國食品學報，2010，10(5):74-77．

［15］劉晶，黃珊珊，趙征．乳酸菌抗氧化能力研究進展［J］．中國乳品工業(yè)，2010，38(5):38-41．

［16］Kullisaar T，Zilmer M，Mikelsaar M，et al．Two antioxidative Lactobacilli Strains as Promising Probiotics［J］．International Journal of Food Microbiology，2002，72(3):215-224．

［17］Archibald F S，F(xiàn)ridovich I．Manganese and defenses against oxygen toxicity in Lactobacillus Plantarum［J］．Journal of Bacteriology，1981(145):442-451．

［18］Gavin I M，Melnik S M．Zero-length protein-nucleic acid crosslinking by radical-generation coordination complexes as a probe for analysis of protein-DNA interactions in vitro and in vivo［J］．Analytical Biochemistry，1998(263):26-30．

［19］劉勇，張勇，包艷，等．4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究［J］．中國食品學報，2010，10(2):28-34．

［20］王麗群，張佰榮，王彥，等．雙歧桿菌體外對Caco-2的黏附及其表面性質(zhì)分析［J］．微生物學報，2010，50(5):606-613．

(責任編輯:葉紅波)

Probiotic Properties of Two Self-chosen Lactobacillus Strains

LIN Xiao-zi1，2， LIANG Zhang-cheng1，2， HE Zhi-gang1，2， LI Wei-xin1，2， REN Xiang-yun1，2
(1．Institute of Agricultural Engineering Technology，F(xiàn)ujian Academy Agricultural Sciences，F(xiàn)ujian Fuzhou 350003，China;2．Agricultural Products Storage and Process Research Centre，F(xiàn)ujian Academy Agricultural Sciences，F(xiàn)ujian Fuzhou 350013，China)

The probiotic properties of two self-chosen lactobacillus strains were studied to provide the theorerical foundation for the research and development of lactic acid fermentation beverage．The stress resistance of lactobacillus plantarum R23 and lactobacillus casei R35 were investigated in a simulated enviroment of gastric acidity and bile salts，the adhesion ability were determined such as their aggregation properties and cell-surface hydrophobicity．The antioxidation of the broth including the scavenging effects on superoxide radical and hydroxyl radical was evaluated in vitro．The results showed that the stress resistance of the both strains was superior to the control group lactobacillus delbrueckii subsp 6045．The tolerance of pH value was 2.5 and bile salt was 5 g·L－1for the lactobacillus plantarum R23，showing the strongest stress resistance．The adhesion of the lactobacillus casei R35 was the strongest in contrast with the control group，the hydrophobicity of the lactobacillus paltarum R23 was stronger，while its aggregation properties was weaker．The extracellular products of three strains had antioxidant capacity after 24 h culture，while lactobacillus paltarum R23 showed the best．Its scavenging rate to superoxide radical and hydroxyl radical was 77.8%and 80.94%respectively，which was 36.72%and 5.81%higher than the control group．

lactobacillus plantarum;lactobacillus casei;probiotic properties;antioxidation

TS201.3

A

1671-1513(2012)01-0030-06

2011-11-08

福建省科技計劃項目(2011R1017－4)．

林曉姿，女，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工方面的研究．

何志剛，男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工方面的研究．通訊作者．