畫寶勇，馬麗華，李時(shí)恩

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院鄭州 450052

#通訊作者，男，1975年11月生，碩士，副教授，研究方向:公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，E-mail:hby@zzu.edu.cn

重鉻酸鉀對(duì)A549細(xì)胞MSH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

畫寶勇1)#，馬麗華2)，李時(shí)恩1)

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院鄭州 450052

#通訊作者，男，1975年11月生，碩士，副教授，研究方向:公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，E-mail:hby@zzu.edu.cn

重鉻酸鉀;MSH2基因;錯(cuò)配修復(fù)基因;A549細(xì)胞

目的:研究重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對(duì)A549細(xì)胞MSH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法:體外培養(yǎng)條件下用0、1.25×10－6、2.50×10－6及5.00×10－6μmol/L的K2Cr2O7溶液染毒A549細(xì)胞24 h后，分別用MTT法、Realtime PCR及Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞活性、MSH2 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果:隨K2Cr2O7作用濃度的升高，A549細(xì)胞活性、MSH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均逐漸降低(F=175.040、66.128和33.326，P＜0.001)。結(jié)論: K2Cr2O7影響A549細(xì)胞的損傷修復(fù)。

六價(jià)鉻是一種重金屬環(huán)境污染物，已被證實(shí)具有致癌性，有較強(qiáng)的氧化能力，可以導(dǎo)致DNA損傷，干擾DNA修復(fù)。MSH2是高度保守的DNA錯(cuò)配修復(fù)基因，可以預(yù)防自發(fā)突變的堆積，保證DNA復(fù)制的完整性和穩(wěn)定性［1］。MSH2蛋白能與DNA雙鏈中的G-T、A-C錯(cuò)配特異結(jié)合，還能與(CA)4及含14個(gè)堿基的插入/缺失環(huán)錯(cuò)配結(jié)合［2］?，F(xiàn)已證實(shí)其基因突變與一些散發(fā)性腫瘤的發(fā)病危險(xiǎn)性相關(guān)，如皮膚癌、直腸癌、胃癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌等［3-4］?；谝陨戏治?，該研究旨在探討重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對(duì)人胚肺A549細(xì)胞MSH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究六價(jià)鉻致癌機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與主要試劑 A549細(xì)胞購于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)?？俁NA提取試劑盒(寶生物工程有限公司)，人MSH2擴(kuò)增引物、人GAPDH擴(kuò)增引物、Real time PCR試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，兔抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人MSH2單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)公司)，ECL顯色試劑盒(美國(guó)PIERCE公司)，MTT(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，1～2 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至倒置顯微鏡下80%視野進(jìn)行傳代，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。消化A549細(xì)胞，按每孔3.5× 104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)液，分別加入含0、1.25×10－6、2.50×10－6及5.00×10－6μmol/L K2Cr2O7的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，每濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行下列指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞增殖抑制率 收集各組細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)波長(zhǎng)495 nm，以光密度(OD)值反映細(xì)胞活性。

1.3.2 細(xì)胞中MSH2 mRNA的檢測(cè) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，鑒定其純度和完整性以后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行Real time PCR。使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。MSH2引物序列:上游5’-GGTGTCCATATGAG GCGTAT-3’，下游 3’-TGAAGTTGTCGCTGTGACG GT-5’，產(chǎn)物大小166 bp;GADPH引物序列:上游5’-GGGAAACTGTGGCAGTGGAT-3’，下游 3’-TGAAGTTGTCGCTGTGACGGT-5’，產(chǎn)物大小 100 bp。擴(kuò)增體系為25 μL，反應(yīng)條件:segment 1為95℃30 s 1個(gè)循環(huán);segment 2為95℃5 s，60℃20 s，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算 2－ΔΔCt。ΔCt = Ct目的基因－Ct內(nèi)參，ΔΔCt=△Ct實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對(duì)照組。

1.3.3 細(xì)胞中MSH2蛋白的檢測(cè) 提取各組支持細(xì)胞中總蛋白，BradFord法進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定蛋白上樣量。然后用Western blot法檢測(cè)MSH2蛋白，一抗按300倍稀釋，二抗按500倍稀釋。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、定影顯影等步驟，最后使用GENESNAP軟件對(duì)所得的結(jié)果做半定量分析。以目的蛋白與GAPDH條帶光密度值的比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析比較不同濃度組A549細(xì)胞的細(xì)胞活性、MSH2 mRNA和蛋白的表達(dá)量，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 K2Cr2O7作用后A549的細(xì)胞活性變化K

2Cr2O7處理 A549細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞活性隨K2Cr2O7濃度的升高而降低，見表1。

2.2 K2Cr2O7作用后A549細(xì)胞MSH2 mRNA及蛋白的表達(dá) K2Cr2O7處理 A549細(xì)胞24 h后，MSH2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨K2Cr2O7濃度的升高而降低，見表1。

表1 K2Cr2O7作用后A549細(xì)胞活性、MSH2 mRNA及蛋白的表達(dá)

3 討論

鉻是一種天然金屬元素，六價(jià)鉻是一種重金屬環(huán)境污染物，主要存在于工業(yè)生產(chǎn)中，并已被證實(shí)具有致癌性［5］。錯(cuò)配修復(fù)基因是生物進(jìn)化過程中的保守基因，屬管家基因，具有識(shí)別、修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配、增強(qiáng)DNA復(fù)制的忠實(shí)性、維持基因組穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變的功能，在多種腫瘤組織中具有不同的表達(dá)譜。近年來，錯(cuò)配修復(fù)基因在腫瘤組織中的作用是研究的熱點(diǎn)。Zhitkovich［6］發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷細(xì)胞染毒六價(jià)鉻后細(xì)胞存活率高于正常細(xì)胞，認(rèn)為錯(cuò)配修復(fù)基因在六價(jià)鉻誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起著促進(jìn)或協(xié)同作用。Kouso等［7］使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，113例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者癌組織hMSH2蛋白表達(dá)顯著減少，hMSH2的表達(dá)與吸煙狀態(tài)有很大的關(guān)聯(lián)。Xinarianos等［8］研究了150例NSCLC患者癌組織中hMSH2蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)hMSH2蛋白低表達(dá)對(duì)肺癌的發(fā)生有著重要的影響。

作者觀察到，隨著K2Cr2O7作用濃度的增高，A549細(xì)胞的活性逐漸降低，MSH2蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量也逐漸降低。由此得知，K2Cr2O7對(duì)A549細(xì)胞的抗損傷修復(fù)能力產(chǎn)生了影響，損傷的細(xì)胞如果沒有修復(fù)或者死亡而繼續(xù)復(fù)制，使大量錯(cuò)誤信息在細(xì)胞內(nèi)不斷積聚，可能最終導(dǎo)致細(xì)胞性質(zhì)改變。

［1］Trouiller B，Schaefer DG，Charlot F，et al.MSH2 is essential for the preservation of genome integrity and prevents homeologous recombination in the moss Physcomitrella patens［J］.Nucleic Acids Res，2006，34(1):232

［2］李瑛，許建寧.001 DNA錯(cuò)配修復(fù)基因 hMSH2與腫瘤關(guān)聯(lián)的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2008，35 (1):1

［3］Gomez RL，Galles C，Spampinato CP.High-level production of MSH2 from Arabidopsis thaliana:a DNA mismatch repair system key subunit［J］.Mol Biotechnol，2011，47(2): 120

［4］Li T，Suo Q，He D，et al.Esophageal cancer risk is associated with polymorphisms of DNA repair genes MSH2 and WRN in Chinese population［J］.J Thora Oncol，2012，7 (2):448

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［7］Kouso H，Yoshino I，Miura N，et al.Expression of mismatch repair proteins，hMLH1/hMSH2，in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance［J］.J Surg Oncol，2008，98(5):377

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Effects of potassium bichromate on expression of MSH2 mRNA and protein in A549 cells

HUA Baoyong1)，MA Lihua2)，LI Shi’en1)1)Department of Occupational Health，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)College of Stomatology，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

potassium bichromate;MSH2;mismatch repair gene;A549 cell

Aim:To observe the effect of potassium bichromate on the expression of MSH2 mRNA and protein in A549 cells.Methods:A549 cells were treated with 0，1.25×10－6，2.50×10－6and 5.00×10－6μmol/L potassium bichromate for 24 h，then cells survival ability，the expressions of MSH2 mRNA and protein were detected by MTT，Real time PCR and Western blot methods，respectively.Results:Cells survival ability，the MSH2 mRNA and protein expression in A549 cells decreased with the potassium bichromate concentration increasing(F=175.040，66.128 and 33.326，P＜0.001).Conclusion:Potassium bichromate can affect the ability of damage repair of A549 cells.

R135.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.029

(2012-03-14收稿 責(zé)任編輯王 曼)