耿莉娜，韓麗萍，張曉雪，李萌萌，趙先蘭

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1969年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科內(nèi)分泌與腫瘤，E-mail:hanlp0825@yahoo.com.cn

子癇前期患者胎盤組織和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中即刻早期反應(yīng)基因X-1蛋白的表達(dá)

耿莉娜，韓麗萍#，張曉雪，李萌萌，趙先蘭

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1969年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科內(nèi)分泌與腫瘤，E-mail:hanlp0825@yahoo.com.cn

即刻早期反應(yīng)基因X-1;子癇前期;胎盤;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

目的:探討子癇前期(PE)患者胎盤組織和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中即刻早期反應(yīng)基因X-1(IEX-1)蛋白的表達(dá)。方法:應(yīng)用免疫組化SP法檢測10例輕度PE、20例重度PE患者和20例正常足月孕婦(正常妊娠組)胎盤組織中IEX-1蛋白的表達(dá)。將HUVEC分別用胎牛血清(陰性對(duì)照組)、正常晚孕婦靜脈血清(正常妊娠組)和重度PE患者血清(重度PE組)孵育24 h，然后應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測細(xì)胞中IEX-1蛋白的表達(dá)，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果:IEX-1蛋白主要表達(dá)于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)，3組胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及底蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.620、16.932，P＜0.001)，重度PE組的表達(dá)強(qiáng)于輕度PE組(P＜0.05)，輕度PE組強(qiáng)于正常妊娠組(P＜0.05)。正常妊娠組及重度PE組HUVEC胞質(zhì)中有IEX-1蛋白的表達(dá)，且較陰性對(duì)照組明顯增強(qiáng)(H=11.495，P=0.003)。陰性對(duì)照組、正常妊娠組和重度PE組HUVEC細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.438，P＜0.001)，重度PE組高于其他2組(P＜0.05)。結(jié)論:IEX-1可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞凋亡，參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，在PE發(fā)病中起著重要作用。

子癇前期(preeclampsia，PE)是人類妊娠期所特有的疾病，以蛋白尿和高血壓為主要特征，是導(dǎo)致圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦和嬰兒病率及死亡率增高的重要原因之一，其病理機(jī)制可能與血管內(nèi)皮損傷、母-胎免疫平衡失調(diào)、滋養(yǎng)細(xì)胞缺血等有關(guān)。即刻早期反應(yīng)基因X-1(immediate early response gene X-1，IEX-1)作為“即刻早期基因”成員，能在生長因子、炎癥因子及缺血缺氧等因素誘導(dǎo)下快速表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等各過程［1-5］。作者對(duì)PE患者胎盤組織和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中IEX-1的表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其與PE發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 胎盤標(biāo)本的來源及處理

1.1.1 臨床資料 選取2010年9月至12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院分娩的50例產(chǎn)婦作為研究對(duì)象，其中PE患者30例(包括輕度PE 10例，重度PE 20例)，正常晚孕婦20例(正常妊娠組)。輕度PE、重度PE和正常妊娠組的年齡分別為21～40 (31.5±5.6)歲、22～41(32.1±5.6)歲、22～38 (29±4.4)歲;孕周分別為35+1～40+2(37.6±1.1)周、34+3～39+3(36.7±0.9)周、36～41+5(38.3± 1.2)周。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第 7版［5］，均排除有糖尿病、心臟病、免疫系統(tǒng)疾病、肝腎疾病等慢性疾病史的孕婦。

1.1.2 胎盤標(biāo)本 胎盤自然娩出后，迅速選取母面中央約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm兩塊，避開出血、鈣化、機(jī)化的部位，用生理鹽水反復(fù)漂洗后，置入甲醛溶液固定。將胎盤組織常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組化測定。收集10例重度PE患者和正常晚孕婦靜脈血各5 mL，制備血清備用。

1.2 HUVEC的來源及處理 HUVECY購自美國ATTCC細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，常規(guī)加青霉素400萬U/ L、鏈霉素100萬U/L。培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度，2～3 d更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 胎盤組織中IEX-1蛋白檢測 切片常規(guī)脫蠟至水并微波修復(fù)抗原。采用免疫組化SP法檢測，按免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行操作。一抗為兔抗IEX-1多克隆抗體［2］(按300倍稀釋)，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，采用已知IEX-1蛋白表達(dá)陽性的卵巢組織石蠟切片作為陽性對(duì)照。陽性細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞質(zhì)棕色、褐色著色。根據(jù)陽性細(xì)胞分布和細(xì)胞染色強(qiáng)度確定IEX-1的表達(dá)水平。首先，高倍鏡下選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，0%計(jì)為0分，＜25%為1分，25%～為2分，＞50%為3分。再根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:無染色或染色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色或褐色為3分。取以上2項(xiàng)的乘積:積分0～1為陰性(－);2～3分為弱陽性(+);4～5分為陽性();＞5分為強(qiáng)陽性()。

1.3.2HUVEC中IEX-1蛋白檢測 將HUVEC經(jīng)胰酶消化收集后，分別以5×105個(gè)/孔接種于含載玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。至對(duì)數(shù)生長期時(shí)分為陰性對(duì)照組、正常妊娠組和重度PE組3組，分別用含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清、含體積分?jǐn)?shù)12%正常晚孕婦靜脈血清和含體積分?jǐn)?shù)12%重度PE患者血清的RPMI 1640培養(yǎng)液孵育細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞至80%～90%融合后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞3次，多聚甲醛固定，用Triton液進(jìn)行細(xì)胞通透，用體積分?jǐn)?shù)5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉。在細(xì)胞爬片上滴加一抗工作液IEX-1(按300倍稀釋)，37℃孵育1～2 h。PBS沖洗5 min×3次。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30 min; DAB顯色，蘇木精復(fù)染后常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察并攝片。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，用已知陽性切片作陽性對(duì)照。結(jié)果判定方法同1.3.1。

1.3.3HUVEC細(xì)胞增殖能力測定 將HUVEC以5×105個(gè)/孔接種在96孔板內(nèi)，細(xì)胞分組及培養(yǎng)同1.3.2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，采用MTT法測定細(xì)胞增殖能力，按試劑盒說明操作，檢測波長490 nm，細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，采用秩和檢驗(yàn)分析3種胎盤組織及3組HUVEC中IEX-1蛋白的表達(dá)水平，用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)比較3組細(xì)胞增殖抑制率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 輕、重度PE患者及正常妊娠組胎盤組織中IEX-1蛋白的表達(dá) 3組胎盤組織中均可檢測到IEX-1蛋白，主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞，少量表達(dá)于絨毛間質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞。PE組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和底蛻膜細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)均較正常妊娠組增強(qiáng)，重度PE組表達(dá)較輕度PE組增強(qiáng)。見圖 1、表1。 *H=26.020，P＜0.001;△H=16.932，P＜0.001。

圖1 3組胎盤組織中IEX-1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 3組胎盤組織中IEX-1蛋白表達(dá)情況比較

2.23組HUVEC中IEX-1蛋白的表達(dá) 見圖2、表2。由圖2、表2可以看出，陰性對(duì)照組HUVEC胞質(zhì)有極少量IEX-1蛋白的表達(dá)，正常妊娠組及重度PE組IEX-1蛋白的表達(dá)較陽性對(duì)照組明顯增強(qiáng)。

圖23 組HUVEC中IEX-1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表23 組HUVEC中IEX-1蛋白表達(dá)的比較 陽性例數(shù)

2.3 3組HUVEC增殖抑制率的比較 陰性對(duì)照組、正常妊娠組和重度PE組細(xì)胞增殖抑制率分別為(0.160±0.021)%、(0.197±0.012)%和(0.480± 0.015)%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 113.438，P＜0.001)，重度PE組HUVEC增殖抑制率高于其他2組(P＜0.05)。

3 討論

人類胎盤形成的關(guān)鍵是滋養(yǎng)細(xì)胞向母體子宮內(nèi)膜和肌層的成功浸潤，該過程需滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化和侵蝕及蛻膜細(xì)胞的增殖與退化同時(shí)并存，并在動(dòng)態(tài)平衡中協(xié)調(diào)蛻膜細(xì)胞的數(shù)量和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕，若該平衡紊亂，可能導(dǎo)致一系列的病理性妊娠［6-7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)PE患者存在胎盤淺著床和子宮螺旋動(dòng)脈重建失敗，這些變化可能與滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)改變有關(guān)。正常妊娠過程中存在滋養(yǎng)細(xì)胞正常凋亡現(xiàn)象，而PE患者胎盤組織中存在細(xì)胞過度凋亡現(xiàn)象，提示胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞異常凋亡與PE的發(fā)病密切相關(guān)。

IEX-1屬即刻早期基因家族成員，能在外界信號(hào)刺激下快速、短暫地表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控下游長期反應(yīng)基因的表達(dá)，在細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用［1-4］，與病毒感染、心血管疾病、炎癥的免疫調(diào)控及腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)［9-12］。已有研究［12］發(fā)現(xiàn)IEX-1可通過調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞中ERK信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用。推測IEX-1可能參與了細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路(如 NF-κB、ERK、ROS、PI3K/Akt等)［12-14］，從而使細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境的變化。

該研究結(jié)果表明，正常妊娠產(chǎn)婦和PE患者的胎盤組織內(nèi)均有IEX-1的表達(dá)，主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞，PE患者胎盤組織中IEX-1蛋白的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常妊娠組，且隨病情嚴(yán)重程度的增加而增強(qiáng)。推測PE患者全身小血管痙攣，各臟器血液灌注減少，胎盤存在缺血缺氧，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞中應(yīng)激蛋白IEX-1的表達(dá)。作者進(jìn)一步用PE患者靜脈血清干預(yù)HUVEC，觀察內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力以及IEX-1合成能力。結(jié)果顯示，正常情況下HUVEC中有極少量IEX-1蛋白表達(dá)，用正常妊娠孕婦及重度PE患者的血清孵育后，IEX-1蛋白在HUVEC中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)重度PE組HUVEC增殖能力明顯下降，說明PE患者血清誘導(dǎo)了HUVEC中IEX-1蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可使HUVEC受損，推測IEX-1蛋白在PE內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中可能起重要的橋梁作用。

目前IEX-1在PE胎盤組織以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，不能確定IEX-1的異常表達(dá)究竟是PE的原因抑或是疾病的結(jié)果。進(jìn)一步深入研究IEX-1在胎盤細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程的調(diào)節(jié)機(jī)制，可增加對(duì)PE發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，可能從蛋白和(或)基因水平找到新的干預(yù)靶點(diǎn)，為PE的診治及預(yù)后判斷提供新途徑。

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Expression of immediate early response gene X-1 protein in placenta of preeclampsia patients and human umbilical vein endothelial cells

GENG Lina，HAN Liping，ZHANG Xiaoxue，LI Mengmeng，ZHAO XianlanDepartment of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

immediate early response gene X-1;preeclampsia;placenta;human umbilical vein endothelial cell

Aim:To explore immediate early response gene X-1(IEX-1)protein expression in preeclampsia(PE)placenta and human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).Methods:Thirty patients with PE(10 cases were mild，and 20 cases were severe)and 20 normal pregnant women(control group)were subjected to detect IEX-1 protein in placenta using immunohistochemistry.HUVECs were cultured with fetal calf serum(negative control group)，the serum of normal pregnant women(normal control group)，and the serum of severe PE patients(severe PE group)for 24 h，respectively，then the IEX-1 expression in the cells was detected by immunocytochemical method，and the proliferation inhibition rate was detected by MTT.Results:The expression of IEX-1 protein mainly lay in cytoplasm of placental trophoblast cells and decidual cells.There were significant differences in the expression of IEX-1 protein in placental trophoblast cells and decidual cells among the 3 groups(H=26.620，16.932，P＜0.001)，which as the highest in the severe PE group(P＜0.05)，and lowest in the control group(P＜0.05).IEX-1 expression in HUVECs of the normal control group and severe PE group were stronger than that of negative control group(H=11.495，P=0.003).The difference in proliferation inhibition rate of HUVECs among the 3 groups was significant(F=113.438，P＜0.001)，and that of severe PE group was higher than the other 2 groups(P＜0.05).Conclusion:IEX-1 may play an important role in the pathogenesis of PE through regulating placental villous trophoblast cells and decidual cells apoptosis，as well as participation in endothelial cell injury process.

R714.24

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.016

(2012-01-03收稿 責(zé)任編輯王 曼)