王 瑞，張 杰，張衛(wèi)星，秦俊昌，王 磊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室;鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所鄭州 450052 #通訊作者，男，1957年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:泌尿外科、男科學(xué)，E-mail:huzi918@hotmail.com

黃芪多糖對大劑量60Co γ射線損傷大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響*

王 瑞，張 杰，張衛(wèi)星#，秦俊昌，王 磊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室;鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所鄭州 450052 #通訊作者，男，1957年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:泌尿外科、男科學(xué)，E-mail:huzi918@hotmail.com

黃芪多糖;睪丸間質(zhì)細(xì)胞;60Co γ射線;大鼠

目的:探討黃芪多糖(APS)對60Co γ射線損傷大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的防治作用。方法:雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白對照組、60Co γ照射組、APS+60Co γ照射組。觀察各組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;ELISA法檢測血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)的含量;RT-PCR法檢測睪丸間質(zhì)細(xì)胞黃體生成素受體(LHR)mRNA水平。結(jié)果:與空白對照組相比，60Co γ照射組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核皺縮，數(shù)目減少;APS+60Co γ照射組睪丸組織病理改變較60Co γ照射組減輕。3組大鼠血清T及LH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.446和1.142，P＞0.05)，睪丸組織中LHR的mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.032，P＜0.001)。結(jié)論:APS可防治60Co γ射線對睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞LHR mRNA的高表達(dá)有關(guān)。

黃芪多糖(astragalus polysacharin，APS)是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激及抗氧化等作用［1-3］。有研究［4］證明60Co γ射線適當(dāng)劑量照射會導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致生精功能障礙。作者采用60Co γ射線對SD大鼠進(jìn)行一次性大劑量睪丸區(qū)域局部照射，觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞的輻射損傷情況及APS對該損傷的防護(hù)作用，為臨床上因射線致睪丸功能受損的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑 清潔級、雄性、8周齡SD大鼠30只，體質(zhì)量(180±15)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號scxk(豫)2005-0001。APS購自陜西森弗生物有限公司，純度95%。使用前以5 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，食品級，購自鄭州萬利來食品添加劑有限公司)按所需含量配制。60Co γ射線源(GWGP80型60Co治療機(jī)，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及建模 將大鼠隨機(jī)分為3組:空白對照組，60Co γ照射組，APS+60Co γ照射組，每組10只。前2組以生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃，第3組以80 mg/(kg·d)APS灌胃20 mL/(kg· d)。2周后，60Co γ照射組、APS灌胃+60Co γ照射組大鼠給予60Co γ射線8.0 Gy睪丸區(qū)局部照射517 s，源距75 cm，照射面積20 cm×20 cm。繼續(xù)灌胃1周后，禁食12 h，以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛4.0 mL/kg麻醉大鼠，自股動脈采血5 mL，2 000 r/min離心15 min，分離血清置－20℃保存?zhèn)溆?。然后剖取睪丸，一部分用Bouin液固定，供組織學(xué)檢查，另一部分置－80℃冰箱保存，供黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)mRNA檢測。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 每只大鼠左睪丸橫切面切開，取3 mm厚睪丸組織，置于Bouin液固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封固，光鏡觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。采用ELISA法測定各組大鼠血清LH、睪酮(testosterone，T)含量，試劑盒由上海研吉生物科技公司提供。?。?0℃冰箱保存的新鮮睪丸組織約100 mg，加1 mL Trizol(上海生工生物工程有限公司)，UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取睪丸組織的總RNA;取5 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μg cDNA為模板，在Taq聚合酶催化下行PCR擴(kuò)增，參照GenBank中LHR和RPS16 mRNA序列設(shè)計(jì)引物(上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成)，其中RPS16為內(nèi)參照。優(yōu)化PCR反應(yīng)條件(表1)，使PCR產(chǎn)物位于線性擴(kuò)增區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Quantity one凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對含量。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析比較各組血清LH、T及LHR mRNA表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的病理變化 空白對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞多呈橢圓形或三角形，分布在血管周圍、曲精小管之間，細(xì)胞大，胞質(zhì)豐富;細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，染色較淡(圖1A)。60Co γ照射組可見睪丸間質(zhì)細(xì)胞位于精曲小管之間的間質(zhì)中，呈圓形、多邊形或短梭形，較稀疏，有的甚至單個散在分布，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)濃集、深染(圖1B)。APS+60Co γ照射組睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷現(xiàn)象較60Co γ照射組有所恢復(fù)，形態(tài)接近正常(圖1C)。

2.2 3組大鼠血清LH、T水平及睪丸組織中LHR mRNA的表達(dá)的比較 見表2。

表23 組大鼠血清LH、T水平及睪丸組織中LHR mRNA的表達(dá)的比較

圖13 組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

3 討論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞又稱睪丸間隙細(xì)胞，分布于生精小管之間的間隙組織中，含量占睪丸細(xì)胞數(shù)量的2%～4%，其功能主要是分泌T，動物體內(nèi)約95%左右的T是睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的［5］。有研究［4］證明60Co γ射線大劑量照射(單次照射劑量6.0 Gy及以上)會導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞及生精細(xì)胞損傷，從而使生精功能障礙。以往研究［6］證實(shí)，γ射線照射后會引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使抗氧化酶類活性降低及過氧化物的含量升高，進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生損傷。因輻射而產(chǎn)生的大量自由基，可攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)的過氧化，使膜的穩(wěn)定性受破壞，從而使相關(guān)蛋白合成和分泌受到影響［7］。Sivakumar等［8］亦在相關(guān)研究中得出類似結(jié)論，認(rèn)為大劑量60Co γ射線輻射除降低LH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之外，還可直接影響類固醇物質(zhì)的合成機(jī)制。該研究結(jié)果表明:大劑量的60Co γ射線局部照射大鼠睪丸會使睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并影響間質(zhì)細(xì)胞表面LHR的表達(dá)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究［9-10］認(rèn)為黃芪的主要活性成分是多糖類、苷類等，具有抗輻射、抗缺氧等作用。研究［11］認(rèn)為APS的抗輻射作用是基于其逆轉(zhuǎn)SOD活性的降低，并能有效清除輻射產(chǎn)生的自由基，使MAD的含量降低，從而降低輻射損傷。該實(shí)驗(yàn)中APS+60Co γ照射組大鼠睪丸病理變化受損程度均較60Co γ照射組輕微，證明APS對60Co γ射線輻射損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有一定防治作用。

T的合成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié)［12］，其中任何一個環(huán)節(jié)受損均會導(dǎo)致其合成障礙。理論上講，輻射后睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上LHR受損，不能有效與LH結(jié)合，會使血中游離的LH增加及睪丸中T的合成減少，釋放入血的T也會減少，通過負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)下丘腦-垂體-睪丸軸，使血中LH進(jìn)一步升高［13］。該實(shí)驗(yàn)中60Co γ照射組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞LHR mRNA表達(dá)確有不同程度降低，血清T、LH雖有波動(升高或降低)，但差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與照射后時間過短，體內(nèi)激素水平代償平衡有關(guān)。因?yàn)椴G丸間質(zhì)細(xì)胞表面LHR受損，排除機(jī)體自身恢復(fù)機(jī)制，長期觀察可能會出現(xiàn)T水平降低，有待后續(xù)相關(guān)研究證實(shí)。

綜上所述，可以看出大劑量60Co γ射線局部照射睪丸會使睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并破壞其表面的LHR。APS對這種輻射損傷具有一定的防治作用，其抗輻射作用機(jī)制之一可能與清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化及促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞LHR mRNA的表達(dá)有關(guān)，是否有臨床應(yīng)用價值，有待于進(jìn)一步深入研究。

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Effects of astragalus polysacharin on rat leydig cells exposed to60Co γ ray

WANG Rui，ZHANG Jie，ZHANG Weixing，QIN Junchang，WANG LeiDepartment of Urology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University;Open Laboratory of Key Discipline of Clinical Medical Sciences，Higher School of Henan Province;the Institute of Molecular Cancer Surgery of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

astragalus polysacharin;leydig cell;60Co γ ray;rat

Aim:To investigate the protection of astragalus polysacharin(APS)on the impairment of the leydig cells caused by higher doses of60Co γ in rats.Methods:Thirty male SD rats were randomized into three groups(n=10):the normal control group，the radiation control group，the APS plus radiation group.The structural changes of the leydig cells were observed with light microscope.The serum luteinizing hormone(LH)and testosterone(T)levels were measured by ELISA; and the mRNA expression level of luteinizing hormone receptor(LHR)from the leydig cells surface was measured by RTPCR.Results:Compared with the normal control group，the leydig cells exhibited decreases in size，cytoplasm，and quantity as well as the nuclear shrinkage after radiation.The mRNA expression levels of LHR were lower(P＜0.01);in the APS irrigation group，the pathological changes of leydig cells were lightly.The mRNA expression levels were close to the normal; the serum LH and T levels were no significant change.Conclusion:APS can reduce the impairment of the leydig cells caused by the higher doses60Co γ ray in rats，which may be involved in its induce the high expression of LHR mRNA.

R285.5;R697.22

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.013

*河南省科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 102102310067

(2011-12-11收稿 責(zé)任編輯趙秋民)