韓艷林，翟明霞，吳亞紅，高艷鋒，祁元明

鄭州大學生物工程系鄭州 450001

#通訊作者，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向:抗原肽和多肽疫苗，E-mail:qym@zzu.edu.cn

腫瘤轉移相關基因1 HLA-A3限制性細胞毒性T淋巴細胞表位的預測與鑒定

韓艷林，翟明霞，吳亞紅，高艷鋒，祁元明#

鄭州大學生物工程系鄭州 450001

#通訊作者，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向:抗原肽和多肽疫苗，E-mail:qym@zzu.edu.cn

腫瘤轉移相關基因1;HLA-A3;細胞毒性T淋巴細胞

目的:鑒定腫瘤轉移相關基因1(MTA1)的HLA-A3限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位。方法:首先運用RT-PCR方法檢測MTA1 mRNA在腫瘤細胞系EC-1、EC-109和T-47D中的表達情況。然后通過BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB 4個軟件預測篩選MTA1 HLA-A3限制性的候選表位。候選表位通過標準Fmoc化學法合成，通過結合力實驗檢測表位與T2A3細胞表面HLA-A3分子的結合力水平，通過體外細胞毒實驗檢測候選肽誘導CTL的能力。結果:MTA1 mRNA在EC-1、EC-109和T-47D細胞中均有表達。候選表位P130與HLA-A3分子有弱結合力，P294、P559與HLA-A3分子有中等結合力。細胞毒實驗結果顯示多肽P130、P294和P559對EC-1細胞均有一定的殺傷作用(F細胞=176.107，F(xiàn)效靶比=48.306，F(xiàn)交互=35.686，P均＜0.001)。結論:多肽P130、P294、P559能夠誘導體外抗腫瘤免疫反應，可能成為新的抗腫瘤多肽疫苗的候選表位。

腫瘤的免疫治療通過激發(fā)和增強機體的免疫功能來控制和殺死腫瘤細胞，而腫瘤治療性多肽疫苗則是腫瘤免疫治療的一個重要方向。新的腫瘤相關抗原的發(fā)現(xiàn)及相應細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位的鑒定推動了多肽疫苗的發(fā)展［1-2］。腫瘤轉移相關基因1(metastasis associated gene 1，MTA1)是1994年Toh等［3］在人乳癌細胞中鑒定發(fā)現(xiàn)的。研究［4］發(fā)現(xiàn)它在多種轉移性腫瘤組織中過表達，如乳癌、食管癌、胃癌、肝癌等，而在正常組織中低表達或不表達，并且其在腫瘤組織中的表達水平與其轉移或浸潤潛能顯著相關。另外，我國有超過50%的人群表達HLA-A3。該研究尋找并鑒定MTA1的HLA-A3限制性CTL表位，并通過細胞毒實驗檢測其殺傷力，為進一步對腫瘤的免疫治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 T2A3細胞系、食管癌細胞系EC-1(HLA-A3+)和EC-109(HLA-A3+)以及乳癌細胞系T-47D(HLA-A3+)由鄭州大學生物工程系多肽生化實驗室常規(guī)保存，于37℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個核細胞(PBMCs)由HLA-A3+健康供者捐贈。RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 腫瘤細胞中MTA1 mRNA的檢測 采用RTPCR法檢測MTA1 mRNA在EC-1、EC-109以及T-47D細胞中的表達。MTA1引物序列:上游 5’-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3’，下游5’-CAC GCTTGGTTTCCGAGGAT-3’，產(chǎn)物大小289 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 HLA-A3限制性CTL表位的預測與合成 結合BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB軟件對MTA1氨基酸序列的預測打分，選出綜合打分較好的HLA-A3限制性表位。候選肽采用標準Fmoc方法合成，經(jīng)HPLC純化后，其純度＞95%，質譜分析其相對分子質量符合理論值。

1.4 候選表位的鑒定

1.4.1 表位肽與HLA-A3分子結合力實驗 收集T2A3細胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，調整細胞濃度至1×109L－1，1 mL/孔，每孔加入待測肽50 mg/L、β2微球蛋白(β2-M)2.5 mg/L，37℃、體積分數(shù)5%CO2共孵育18 h后，冷PBS洗滌3次，加入100 μL稀釋100倍的鼠抗人β2-M一抗，4℃靜置30 min。冷PBS洗滌3次，加入50 μL稀釋50倍的FITC-羊抗鼠二抗，4℃放置40 min，PBS洗滌后用流式細胞儀檢測。其結果用熒光系數(shù)(FI)表示:FI= (表位肽平均熒光強度－背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。FI＞1.0表示高結合力，1.0≥FI≥0.5表示中等結合力，F(xiàn)I＜0.5表示低結合力。

1.4.2 CTL的體外誘導及靶細胞的制備 PBMCs

用含體積分數(shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×109L－1。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，陰性對照組加入10 μL的PBS，無關肽組加入10 mg/L的HBcAg18-27(FLPSDFFPSV)第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細胞，800 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的含體積分數(shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細胞作為效應細胞。胰蛋白酶消化EC-1細胞作為靶細胞。

1.4.3 細胞毒活性檢測 調整效應細胞濃度為5× 109L－1，調整靶細胞濃度為 1×108L－1，分別按50∶1、25∶1、12.5∶1的效靶比鋪于96孔板中，同時設立效應細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組、體積校正組和背景對照組，每孔終體積為100 μL，每組設3個復孔。于37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。于孵育結束前45 min，在靶細胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉移50 μL上清至另一96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min;再加入50 μL/孔終止液。用酶標儀檢測其在490 nm波長處的吸光度(A)值。殺傷率=(實驗孔A值－CTL自發(fā)釋放值－靶細胞自發(fā)釋放值)/(靶細胞最大釋放值－靶細胞自發(fā)釋放值)×100%。

2 結果

2.1 腫瘤細胞中MTA1 mRNA的表達 MTA1在

3種腫瘤細胞系中均有表達。見圖1。

圖1 腫瘤細胞中MTA1 mRNA的表達

2.2 MTA1 HLA-A3限制性CTL表位的預測結果 根據(jù)BIMAS(分值均大于10)、SYFPEITHI(分值均大于20)、NetCTL 1.2(分值均大于1.0)及IEDB(分值均小于1.0)軟件預測結果篩選出分值較好的CTL表位，共5條九肽。見表1。

表1 MTA1 HLA-A3限制性CTL表位預測和結合力實驗結果

2.3 表位肽與HLA-A3分子結合力實驗結果 見表1。P130、P353、P670具有弱結合力，P294、P559具有中等結合力。

2.4 細胞毒實驗結果 見表2。

表2 P130、P294和P559誘導的CTL對EC-1的殺傷率(n=3) %

3 討論

腫瘤轉移是一個涉及多種原因及其產(chǎn)物的復雜過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，侵入淋巴管、血管及周圍組織，誘導血管形成，逃避宿主細胞抗腫瘤反應和在轉移部位生長［5-6］，了解腫瘤轉移所涉及的基因和基因產(chǎn)物是目前國內(nèi)外研究的熱題。作者的研究結果表明MTA1 mRNA在EC-1、EC-109和T-47D細胞中均有表達，提示以上3種細胞均可作為殺傷實驗的靶細胞。

BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB是預測抗原表位肽的常用預測軟件。BIMAS和IEDB預測的重點在于表位肽與HLA分子結合的親和力和穩(wěn)定性，SYFPEITHI是基于超基序的經(jīng)典預測工具，而NetCTL 1.2則綜合了表位肽與HLA分子的結合力、蛋白酶體降解以及轉運相關蛋白呈遞效率這些方面來預測表位［7］。這些軟件主要從MHC分子與表位肽的結合環(huán)節(jié)來預測其結合能力，從而篩選親和力較高的表位肽［8］。然而也有研究［9］表明并非所有與MHC分子有高親和力的表位肽都能有效激發(fā)出特異性CTL。有研究［10］報道，用高親和力的表位肽激發(fā)CTL產(chǎn)生抗腫瘤效應的同時，有發(fā)生自身免疫疾病的可能。而低親和力的多肽疫苗也可以在體內(nèi)誘導有效應能力的CTL，并且避免了自身免疫疾病的發(fā)生。該研究中，作者結合了幾種預測軟件篩選出9個表位，通過結合力實驗最終選擇了兩條具有中等結合力的表位肽P294、P559和一條低結合力的表位肽P130。3條肽均體外誘導出了特異性CTL，并對腫瘤細胞有一定的殺傷作用，提示3條肽均有較好的免疫原性。該研究結果顯示，隨著效靶比增大，殺傷效果也增強。特別是低結合力的表位肽P130，其殺傷效果在50∶1時比另兩條肽略好，這也說明低親和力的表位肽有潛力誘導具有效應能力的CTL［11-12］。

該研究鑒定了3條來源于MTA1的表位P130、P294和P559，在體外細胞毒實驗中所誘導的CTL對靶細胞EC-1均具有殺傷作用且殺傷效果較強。下一步會考慮在已鑒定的CTL表位的基礎上嘗試長肽疫苗、多表位融合疫苗及蛋白疫苗等的研究。

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Identification of HLA-A3 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from metastasis associated gene 1

HAN Yanlin，ZHAI Mingxia，WU Yahong，GAO Yanfeng，QI Yuanming Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

metastasis associated gene 1;HLA-A3;cytotoxic T lymphocyte

Aim:To identify the HLA-A3 restricted cytotoxic T lymphocyte(CTL)epitopes from metastasis associated gene 1(MTA1).Methods:RT-PCR was used to determine the expression of MTA1 mRNA in cancer cell lines，EC-1，EC-109 and T-47D.HLA-A3 epitopes from MTA1 protein were predicted by BIMAS，SYFPEITHI，NetCTL 1.2 and IEDB.Peptides were synthesized by standard Fmoc chemistry method.Their binding affinities towards HLA-A3 molecule were evaluated by T2A3 cells binding assay.Their ability to induce T cell response was investigated by using cytotoxicity assay in vitro.Results: The expression of MTA1 mRNA was observed in EC-1，EC-109 and T-47D cells.The candidate peptide P130 showed weak affinity towards HLA-A3 molecule，while P294 and P559 showed moderate affinity.The CTLs induced by all the three peptides could lyse EC-1 cells(Fcell=176.107，F(xiàn)ratio=48.306，F(xiàn)interaction=35.686，P＜0.001).Conclusion:The peptides P130，P294，and P559 could induce anti-tumor inmmunity in vitro and serve as candidates towards antitumor peptide vaccines.

Q279

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.008*國家自然科學基金資助項目 81172893，30901362;鄭州大學研究生科學研究基金資助項目 11L00403

(2012-03-06收稿 責任編輯李沛寰)