高 媛，劉振華，馮菁華，李曉云，孫其喆，張 寶，鄭文嶺，馬文麗#

1)南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所廣州 510515 2)蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州 215009 3)華南基因組研究中心廣州 510800 #通訊作者，女，1964年4月生，博士，教授，研究方向:基因診斷與基因治療，E-mail:wenli668@gmail.com

pp GalNacT-10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)*

高 媛1)，劉振華2)，馮菁華1)，李曉云1)，孫其喆1)，張 寶1)，鄭文嶺1，3)，馬文麗1)#

1)南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所廣州 510515 2)蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州 215009 3)華南基因組研究中心廣州 510800 #通訊作者，女，1964年4月生，博士，教授，研究方向:基因診斷與基因治療，E-mail:wenli668@gmail.com

pp GalNacT-10;真核表達(dá)載體;293T細(xì)胞

目的:構(gòu)建pp GalNacT-10基因真核表達(dá)載體。方法:采用PCR方法合成含有酶切位點(diǎn)(XbaⅠ、EcoRⅠ)的pp GalNacT-10 cDNA。構(gòu)建pMD19T-GalNacT-10-ORF和pMD19T-GalNacT-10-antisense，鑒定及測(cè)序證實(shí)cDNA片段大小和序列。雙酶切目的載體pcDNA3.1后，與GalNacT-10-ORF和GalNacT-10-antisense片段進(jìn)行連接，構(gòu)建正義和反義真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF和pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense，將其分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)pp GalNacT-10蛋白的表達(dá)。結(jié)果:pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF和pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense包含大小、序列正確的pp GalNacT-10片段;pp GalNacT-10蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF的293T細(xì)胞中高表達(dá)，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense的293T細(xì)胞中表達(dá)降低。結(jié)論:成功構(gòu)建了pp GalNacT-10基因正義和反義真核表達(dá)載體。

根據(jù)糖鏈和肽鏈連接方式的不同，蛋白質(zhì)的糖基化可分為N-糖基化和O-糖基化［1］，目前關(guān)于蛋白N-糖基化研究較多，而蛋白O-糖基化研究較少。多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferases，pp GalNAcTs)是O-糖鏈合

*廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 S2011040003098成的起始糖基轉(zhuǎn)移酶，催化UDP-GalNAc上的Gal-NAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)多肽鏈上特定序列中的Thr或Ser的羥基上，從而合成 GalNAcα-O-Ser/Thr多肽，而后在其他糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下肽鏈逐漸延伸［2］。酶的缺乏或者活性降低等可以導(dǎo)致多種疾?。?］，研究［4-7］發(fā)現(xiàn)，pp GalNAcTs家族與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶10(pp GalNAcT-10)是多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，它對(duì)腫瘤的影響目前暫無(wú)相關(guān)報(bào)道。作者構(gòu)建pp GalNAcT-10正義真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF和反義真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步在分子水平研究pp GalNAcT-10對(duì)腫瘤的影響提供物質(zhì)基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎上皮細(xì)胞系(293T)、大腸桿菌菌株DH5α、pcDNA 3.1(－)由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所保存;Lipofectamine 2000、Trizol購(gòu)自 Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶 XbaⅠ和EcoRⅠ購(gòu)自TaKaRa公司;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hy-Clone公司)，pp GalNAcT-10一抗(Abcam公司)、二抗(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，DNA回收試劑盒(上海晶美生物工程公司)，小量質(zhì)粒提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，雙抗、二甲基亞砜、胰蛋白酶(Sigma公司)。

1.2 293T細(xì)胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)傳代。用Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA，測(cè) RNA濃度、純度。以總RNA為模板，使用Promega公司的試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，得到ppGalNAcT-10基因的cDNA。

1.3 PCR擴(kuò)增、純化 設(shè)計(jì)pp GalNAcT-10正義載體引物，上游 GLANT-ORF-F(XbaⅠ):5’-AGTCTAGAATGAGGCGGAAGGAGAAGCGGCTC-3’，下游GLANT-ORF-R(EcoRⅠ):5’-AGGAATTCT CAGTTCCTATTGAATTTTTCCAA-3’;pp GalNAcT-10反義載體引物，上游GLANT-antisense-F(XbaⅠ):5’-AGTCTAGATCAGTTCCTATTGAATTTTTCCAA-3’，下游GLANT-antisense-R(EcoRⅠ):5’-AGGAATTCAT GAGGCGGAAGGAGAAGCGGCTC-3’。引物由 Invitrogen公司合成。PCR。擴(kuò)增體系為20 mL。擴(kuò)增條件:94℃5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，38個(gè)循環(huán);72℃7 min延伸。按TIANgen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凝膠回收操作。

1.4 目的基因與T載體連接 用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ消化PCR產(chǎn)物及pMD19T載體，將目的基因片段DNA、載體pMD19-T simple、SolutionⅠ加入到滅菌后的200 mL PCR管中，16℃過(guò)夜連接12 h。轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取單克隆，PCR及酶切篩選和鑒定重組質(zhì)粒。陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒后由Invitrogen公司完成測(cè)序，并用DNA Star軟件進(jìn)行核苷酸序列分析。

1.5 克隆載體質(zhì)粒DNA和表達(dá)載體pcDNA 3.1 (－)連接 用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ消化pMD19T重組載體及載體pcDNA 3.1(－)，37℃保溫3 h進(jìn)行酶切，加10×Loading Buffer終止酶切反應(yīng)。T4連接酶4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，Amp抗性篩選重組子，37℃度搖菌14 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 將293T細(xì)胞接種于6孔板，生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，分別采用pcDNA3.1-Gal-NacT-10-ORF和 pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense和Lipofectamine 2000按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(－)質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株為對(duì)照。

1.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的檢測(cè) 將上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h，裂解，收取蛋白。以兔抗人抗體為一抗，鼠抗兔IgG為二抗，用Western blot法檢測(cè)pp GalNAcT-10蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 pp GalNAcT-10 cDNA的RT-PCR克隆 見(jiàn)圖1。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小約1 800 bp，與預(yù)期大小一致。

圖1 pp GalNAcT-10RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 pp GalNAcT-10基因與pMD19T重組載體的構(gòu)建 用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切pMD19T-GalNacT-10-ORF 和 pMD19T-GalNacT-10-antisense，得 到1 800 bp的片段(圖2)，與pp GalNAcT-10 cDNA的大小一致。測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的序列一致。

2.3 重組pp GalNAcT-10基因真核表達(dá)載體的鑒定 見(jiàn)圖3。用雙酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示重組載體所含pp GalNAcT-10cDNA堿基序列與GenBank上完全一致。

2.4 目的蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá) 見(jiàn)圖4。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-GalNAcT-10-ORF的細(xì)胞中pp GalNAcT-10蛋白表達(dá)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-GalNAcT-10-antisense的細(xì)胞中pp GalNAcT-10蛋白表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1空載體與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中pp GalNAcT-10蛋白表達(dá)相似。

圖4 目的蛋白pp GalNAcT-10在293T細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞同胚胎發(fā)育中的正常細(xì)胞一樣，也經(jīng)歷被活化和快速生長(zhǎng)、黏附于其他各種細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)并侵入組織的過(guò)程。脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育和細(xì)胞激活伴有典型的細(xì)胞糖基化類(lèi)型的改變，因此糖基化改變也是細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)展的普遍特征。其中如T抗原等糖抗原在脊椎動(dòng)物胚胎細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)高表達(dá)，常作為腫瘤相關(guān)性糖抗原，用于腫瘤發(fā)展預(yù)后的檢測(cè)［8-9］。T抗原的O型糖基化起始于pp GalNAcTs家族，在乳癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等多種癌變中已有pp GalNAcTs家族中一些成員表達(dá)異常的報(bào)道［4-7］。在偏釩酸鈉誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)ppGalNAcT-2的活性以及表達(dá)量均發(fā)生改變;隨后的試驗(yàn)證明ppGalNacT-2表達(dá)的變化影響偏釩酸鈉誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡［10］。

pp GalNAcT-10是多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，其對(duì)腫瘤的影響目前暫無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，分析該蛋白在細(xì)胞中的作用，有利于找尋與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其惡性特征相關(guān)的新基因。作者成功構(gòu)建了pp GalNacT-10基因正義和反義真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探其對(duì)腫瘤的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and expression of eukaryotic expression vector for pp GalN-acT-10 gene

GAO Yuan1)，LIU Zhenhua2)，F(xiàn)ENG Jinghua1)，LI Xiaoyun1)，SUN Qizhe1)，ZHANG Bao1)，ZHENG Wenling1，3)，MA Wenli1)1)Institute of Genetic Engineering，Southern Medical University，Guangzhou 510515 2)Suzhou Health College，Suzhou 215009 3)South China Genome Research Center，Guangzhou 510800

pp GalNacT-10;eukaryotic expression vector;293T cell

Aim:To construct eukaryotic expression vector of pp GalNacT-10 gene.Methods:PCR synthesis full length of pp GalNacT-10 cDNA containing restriction sites(XbaⅠ，EcoRⅠ).pMD19T-GalNacT-10-ORF and pMD19T-GalNacT-10-antisense were build，and the sequence and size of pp GalNacT-10 cDNA fragment were confimed to be correct.After objective vector pcDNA3.1 was digested，it was separately connected with GalNacT-10-ORF and GalNacT-10-antisense.Sense and antisense eukaryotic expression vectors pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF and pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense were separately transfected into 293T cells.Western blot was used to identify the expressed product.Results:The results of digestion confirmed the right length of inserted DNA，which was the same as the pp GalNacT-10 cDNA，and pp GalNacT-10 protein was highly expressed in 293T cells which were transfected with pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF，and low expressed in 293T cells which were transfected with pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense.Conclusion:pcDNA3.1-GalNacT-10-ORF and pcDNA3.1-GalNacT-10-antisense have been successfully constructed.

R34

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.003

(2012-02-07收稿 責(zé)任編輯趙秋民)