王曄愷 周吉航 周世權(quán) 曾 芳 黃燕燕 劉曉光

血源性乙肝疫苗在我國經(jīng)數(shù)十年近億人次的接種，雖從總體來說具有良好的安全性和免疫原性，但對小部分使用者如新生兒等群體仍存在異源性致敏的風(fēng)險［1］。隨著DNA重組技術(shù)的進展，出現(xiàn)了鼠單抗、小分子抗體等各種重組乙肝表面抗體，但與天然的人抗體分子相比，小分子抗體結(jié)構(gòu)不完整無法發(fā)揮Fc段介導(dǎo)的各種生物學(xué)效應(yīng)，而鼠單抗則不能完全消除抗體的異源性，親和力也低。因此，本研究針對以上的問題，通過流式分選得到抗體分泌細胞(antibody-secreting cells，ASC)群，建立起一種利用單細胞RT-PCR克隆并表達得到能與乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)特異性結(jié)合的人源化乙肝表面抗體(hepatitis B surface antibody，HB-sAb)重鏈，為人源化、個體化的乙肝治療性抗體開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

對象與方法

1．研究對象:選取健康志愿者8名，無各種器質(zhì)性和免疫性疾病史，未接種過乙肝疫苗，乙肝三系各項檢測均為陰性(放射免疫法)，對志愿者注射乙肝疫苗(基礎(chǔ)免疫3針)，完成第3針注射后的第30日清晨各志愿者均空腹抽血20ml，以枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，每份樣本取2ml全血3000r/min離心取500μl血漿檢測其HBsAb濃度(放射免疫法)，篩選得到HB-sAb＞1000mIU/ml的樣本1份。

2．單細胞分選:將篩選出的HBsAb＞1000mIU/ml的血樣(放免儀器為雅培i2000型，乙肝三系定量檢測試劑盒為配套試劑)用 Ficoll液(CEDARLANE-H-CL5020)分離，吸取500μl單個核細胞層懸液，PBS洗滌3次，吸棄上清，加CD3-FITC、CD20-FITC、CD38-PE、CD27-PC5、CD19-APC 各 20 μl(貝克曼-庫爾特)，振蕩混勻，避光靜置20min后，加200μl PBS，標本置流式細胞儀(BD FACSAria高速分選型)上，依次選取 R1→R2→R3門，得到 R1＆R2＆R3細胞群(CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high)，用調(diào)試用96孔板(Axygen公司)確定液滴中心位置，開啟這群細胞的分選，每孔一個細胞，分選多板(圖1)。分選結(jié)束后加蓋并取出微孔板，顯微鏡(Olympus BX60)下計數(shù)并記錄有單個細胞的孔號。

3．乙肝表面抗體重鏈克隆:單細胞RT-PCR模板制備:在顯微鏡下觀察到有單個細胞的微孔中每孔加入1%的NP40(碧云天生物技術(shù)研究所)5μl，42℃孵育 20min，再加 AMV 0．5μl，45℃孵育45min，然后分兩等份，分別用于重鏈部分全長片段和全長片段的克隆。

采用巢式PCR克隆重鏈部分全長片段:取單細胞RT-PCR模板，第1輪PCR加Access Quick Master mix(2×)(Promega 公司)12．5 μl，dNTPs(10mmol/L each)0．5μl，重鏈部分全長片段5'-隨機引物(天根生化)和3'-外側(cè)引物(5'-aaggtgtgcacgccgctggt-3')各 0．5μl(終濃度為 0．6μmol/L)，加ddH2O 補足 25μl，PCR 條件為 95℃ 15min;95℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，30 個循環(huán);72℃ 10min;4℃ 5min。第 2 輪PCR加第一輪 PCR 產(chǎn)物 2μl為模板，2 ×PCR buffer12．5μl，重鏈部分片段5'-隨機引物和3'-內(nèi)側(cè)引物(5'-cggttcggggaagtagtcct-3')各 1μl(終濃度為 0．6μmol/L)，PCR 條件均為:95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35 個循環(huán);72℃5min，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

4．重鏈部分全長PCR產(chǎn)物純化和鑒定:產(chǎn)物切割，用DNA膠回收純化試劑盒(Promega公司)純化，克隆到T載體，挑取20個白斑搖菌，送至中國科學(xué)院北京基因組研究所測序。

5．重鏈全長克隆:取“單細胞 RT-PCR 模板”5μl，重鏈全長引物 5'端引物(5'-atcagatctatggctagt gggaggtgggc-3')0．5μl(終濃度為 1μmol/L)，3'端引物 0．5μl(5'-atcaagctttcatttacccggagaca ggga-3')(終濃度為 1μmol/L)，10 × buffer 5μl，dNTP(25mmol/L)2μl，LA taq 0．5 μl，補 ddH2O 到 25μl。擴增條件為 95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，35 個循環(huán);72℃10min，擴增產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，雙酶切克隆到pEGF-N1成為pEGFP-IgG(H)質(zhì)粒，并送中國科學(xué)院北京基因組研究所測序驗證。

6．pEGFP-IgG(H)轉(zhuǎn)染:pEGFP-IgG(H)質(zhì)粒經(jīng) LipofectAMINETM試劑盒(Life Technologies公司)轉(zhuǎn)染到COS-7細胞，培養(yǎng)72h，取上清4000r/min離心10min，棄沉淀。

7．IgG(H)結(jié)合特異性驗證:HBsAg(北京生物制品研究所)用1×SDS稀釋到10μg/ml，用PCR儀煮沸10min變性，每孔10μl上樣，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白(15%分離膠，5%濃縮膠)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(300mA，30min)，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2h，按照蛋白質(zhì)marker切割PVDF膜，并分別加入1∶50稀釋的上清，4℃過夜。PBS-T洗滌3次，每次10min。再分別加入1∶1000稀釋的羊抗人 IgG-HRP(Santa Cruz)，室溫震搖1h，PBS-T洗滌3次，每次15min。ECL系統(tǒng)顯色，凝膠成像儀(BIO-RADUniversal HoodⅡ型)下攝片，采用Quaintity one分析軟件進行條帶分析。

8．IgG(H)親和力檢測:親和力常數(shù)(ka)測定參照Batty飽和法［2］，將 HBsAg溶解在 5μg/ml的碳酸鈉緩沖液中，室溫包被在96孔板中過夜，PBS-T洗3次，將不同濃度IG(H)上清加到96孔板中，孵育1h，洗去后加HRP標記羊抗人IgG二抗，TMB顯色試劑盒顯色后置酶標儀450nm波長下讀取數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

1．重鏈部分全長PCR產(chǎn)物電泳:條帶約在480bp左右，將其條帶回收后克隆到T載體(圖2)。

圖2 重鏈部分全長電泳

2．重鏈部分全長序列分析:20個白斑搖菌所得的20個序列在NCBI數(shù)據(jù)庫經(jīng)Blast分析，15個克隆全長在600bp～1kb，剩下的5個克隆中有3個是序列相同的克隆，另外2個也是IgG重鏈的序列，本研究中我們只選取了相同序列的3個克隆進一步設(shè)計全長引物擴增其全長。

3．重鏈全長 PCR產(chǎn)物電泳和測序:條帶約在1500bp左右，與預(yù)期長度相符，經(jīng)測序分析重鏈全長基因ORF序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的XP_002348298 95%同源，其Acession number為igg_heavy HQ829365(圖3)。

圖3 重鏈全長PCR產(chǎn)物電泳

4．IgG(H)結(jié)合特異性檢測:Western blotting顯示，pEGFP-N1上清液孵和pEGFP-N1上清液加入10μgHBsAg后孵育均無目的條帶，而 pEGFP-IgG(H)上清液孵育有較強的條帶，但pEGFP-IgG(H)上清液加入10μgHBsAg后條帶灰度降低較大，這說明上清液中加入的HBsAg與4d上的HBsAg競爭性地結(jié)合上清中的重鏈，從而造成4d上的條帶灰度降低(圖4)。

討 論

單克隆抗體自從20世紀70年代制備出來以后，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多學(xué)科發(fā)揮了重要作用，在臨床上對于腫瘤等疾病也有一定的應(yīng)用價值［3］，但治療性單抗目前存在的主要問題是多以鼠源為主，容易被人體免疫系統(tǒng)識別產(chǎn)生人抗鼠抗體而將其清除［4］。因此，單抗的人源化改造成為熱點，這是因為人源化改造后不但減少了機體的免疫排斥反應(yīng)，而且人源化抗體中的Fc段能夠誘發(fā)機體效應(yīng)細胞的殺傷作用［5］。

目前完全人源化抗體的制備方法主要通過抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而我們通過流式分選和單細胞RT-PCR建立的這種從外周血ASC細胞中擴增乙肝表面抗體重鏈基因的技術(shù)，不但達到了完全的人源化，而且從理論上說可以針對個體制備出個體化的抗體，達到個體化治療的目的。由于ASC細胞目前的尚無共同認可的表面標記，Crotty等［6］認為人記憶性B細胞表面標記是CD19+CD20+Ig+CD27+，在受外界抗原刺激7天左右能達到外周血ASC細胞的2%左右，并通過酶聯(lián)斑點免疫法分離得到這群細胞。而本研究則采用Smith K等［7］報道所采用的 CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high這類組合進行篩選ASC細胞。并且單細胞RT-PCR的優(yōu)點在于克隆出來的重鏈和輕鏈和來源于同一ASC細胞，通過連接肽(Gly4Ser)3連接配對后，構(gòu)建出來的抗體可以和自然分泌抗體的分子結(jié)構(gòu)達到高度的相似性，從而最大程度地發(fā)揮抗體的結(jié)合能力，這是一般重組技術(shù)和多細胞模板的RT-PCR無法做到的。

抗體的免疫學(xué)特性主要體現(xiàn)于抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合容量、親和力、特異性3方面，其中測定親和力Ka的方法有平衡透析法、Scatchard plot法和Batty飽和法等［8］，由于Batty飽和法簡單適用，因此本研究用了此法檢測IgG(H)的Ka值達到了2．39×109L/mol，而根據(jù) James等［9］Ka為 107～1012L/mol為高親和力的理論，我們表達得到的IgG(H)親和力較高。在對抗體的特異性鑒定中一般使用交叉反應(yīng)實驗，而本研究只通過設(shè)立多種對照初步地證明IgG(H)對HBsAg具有一定的結(jié)合力，提示此由此重鏈所制備得到的乙肝表面抗體非?？赡芫哂星宄腋尾《镜哪芰Γ诼殬I(yè)暴露、產(chǎn)前阻斷等個體化預(yù)防和治療的應(yīng)用領(lǐng)域有廣泛的前景。

1 Bulbul A，Karadag A，K?klü E，et al．Anaphylactic shock due to hepatitis B immunoglobulin in a newborn［J］．Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine，2010，23(10):1257-1259

2 Batty JD，Beatty BG，Vlahos WG．Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay［J］．J Immunol Methods，1987，100(1-2):173-179

3 Arlen M，Arlen P，Tsang A，et al．The therapeutic value of monoclonal antibodies directed against immunogenic tumor glycoproteins［J］．J Cancer，2010，1:209-222

4 Goto M，Kuribayashi K，Umemori Y，et al．High prevalence of human anti-mouse antibodies in the serum of colorectal cancer patients［J］．Anticancer Res，2010，30(10):4353-4356

5 王業(yè)榮，童德文，李立，等．人源化抗體制備及其應(yīng)用研究進展［J］．生物技術(shù)通訊，2007，18(4):683-687

6 Crotty S，Aubert RD，Glidewell J，et al．Tracking human antigen-specific memory B cells:a sensitive and generalized ELISPOTsystem［J］．J Immunol Methods，2004，286(1-2):111-122

7 Smith K，Garman L，Wrammert J，et al．Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen［J］．Nat Protoc，2009，4(3):372-384

8 王自良，張改平，楊艷艷，等．抗苯巴比妥單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及其免疫學(xué)特性鑒定［J］．核農(nóng)學(xué)報，2006，20(4):336-340

9 James WG．Monoclonal antibodies:principles and practice［M］．Academic press，Inc Ltd，1983:142-147