王訓(xùn)立 謝金東 周建華

睪丸組織中除了生精細(xì)胞外，還有兩種重要的細(xì)胞即支持細(xì)胞(sertoli cells)和間質(zhì)細(xì)胞(leydig cells)［1］。支持細(xì)胞主要功能是維持睪丸曲細(xì)精管的結(jié)構(gòu)、維持血睪屏障的完整性、維護(hù)睪丸組織天然免疫豁免，對生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的營養(yǎng)支持作用，可調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的生理功能，而間質(zhì)細(xì)胞的主要功能是合成和分泌雄激素。因此，間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞是睪丸組織構(gòu)建的種子細(xì)胞。

在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，非人靈長類動物作為高等級的實驗動物模型受到人們重視，而恒河猴作為一種實驗動物得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，雖然我們進(jìn)行了恒河猴睪丸內(nèi)激素調(diào)控的離體研究，但對于支持細(xì)胞對間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的作用機(jī)制還不甚了解［2］。本研究通體外無血清培養(yǎng)的方法，開展了支持細(xì)胞對間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的研究，對于進(jìn)一步了解非人靈長類動物睪丸支持細(xì)胞對間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的調(diào)節(jié)機(jī)制，具有重要的理論價值。

材料與方法

1．試劑:McCoy's 5a培養(yǎng)基購于Gibco公司;牛血清白蛋白(BSA)、人卵泡刺激素(human follicle stimulating hormone，hFSH)、內(nèi)皮素 －1(endothelin－1，ET －1)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、cAMP、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、白細(xì)胞介素 －1(interleukin－1，IL－1)購自Sigma公司;睪酮放射免疫測定藥盒為上海原子核研究所的產(chǎn)品。

2．實驗動物:恒河猴由福建省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(閩)2005－0002，SYXK(閩)2005－0015，單籠飼養(yǎng)，經(jīng)檢驗符合普通級實驗動物標(biāo)準(zhǔn)。

3．支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分離:(1)支持細(xì)胞分離:將取得的睪丸組織在無菌條件用培養(yǎng)液沖洗數(shù)次，在玻璃平皿中將睪丸外周的脂肪和結(jié)締組織等去除，剝除白膜，分離出睪丸實質(zhì)，將其拉松、剪碎，用0．1%BSA－Hepes溶液混合剪碎的睪丸組織，加入膠原酶(Ⅱ)，在37℃消化45min。在尼龍濾網(wǎng)上過濾，離心(1000r/min，5～8min)收集細(xì)胞。經(jīng)BSA密度梯度重力沉降分離細(xì)胞，得到的支持細(xì)胞(sertoli cells)用培養(yǎng)液離心沖洗3次。取20μl細(xì)胞懸液加20μl Trypan bule染色。用血球計數(shù)板確定成活細(xì)胞數(shù)目，此時得到的支持細(xì)胞純度達(dá)95%以上。(2)間質(zhì)細(xì)胞分離:將取得的睪丸組織用培養(yǎng)液沖洗數(shù)次，在玻璃平皿中將睪丸外周的脂肪和結(jié)締組織等去除，剝除白膜，分離出睪丸實質(zhì)，將其拉松、剪碎，用0.1%BSA－Hepes溶液混合剪碎的睪丸組織，加入膠原酶(Ⅱ)，在37℃消化45min。在尼龍濾網(wǎng)上過濾，離心(1000r/min，5～8min)收集細(xì)胞。經(jīng)BSA密度梯度重力沉降分離細(xì)胞，得到的間質(zhì)細(xì)胞(leydig cells)用培液離心沖洗3次。取20μl細(xì)胞懸液加20μl Trypan bule染色。用血球計數(shù)板確定成活細(xì)胞數(shù)目，此時得到的間質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%以上。

4．支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):細(xì)胞培養(yǎng)液由McCoy's 5a培養(yǎng)基配制。分離獲得的間質(zhì)細(xì)胞按每個1ml培養(yǎng)液含105個細(xì)胞接種到直徑35mm的培養(yǎng)皿中，同時接種支持細(xì)胞，支持細(xì)胞按每個1ml培養(yǎng)液含 0、5 ×103、104、2 ×104、5 ×104、105個細(xì)胞分別接種。兩種共培養(yǎng)的細(xì)胞在5%CO2、95%空氣和37℃的條件下培養(yǎng)。每24h更換培養(yǎng)液1次，換液之前在倒置相差顯微鏡下檢查細(xì)胞貼壁和細(xì)胞形態(tài)。第1次換液時用培養(yǎng)液洗兩次以去除細(xì)胞碎片和內(nèi)源激素。

在研究外源因子對共培養(yǎng)細(xì)胞的影響時，隨機(jī)分組后，根據(jù)不同的實驗組分別加入 GnRH(10－7mol/L)，F(xiàn)SH(100ng/ml)，EGF(10－7mol/L)，ET － 1(10－5mol/L)和 IL － 1(10－5mol/L)連續(xù)培養(yǎng)72 h，每天采集培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)液，煮沸15min，凍存于－20℃待測定。同樣實驗重復(fù)3次。

5．睪酮的測定:培養(yǎng)液中的睪酮含量采用放射免疫測定法測定。培養(yǎng)液中睪酮不需提取直接測定，睪酮抗體稀釋度為1∶(5 ×105)，靈敏度為 4 ～7pg，批內(nèi)誤差 2．8%，批間誤差3．5%。

6．統(tǒng)計學(xué)方法:每次實驗重復(fù)3次(SPSS 13．0)，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．促性腺激素釋放激素(GnRH)對睪酮分泌水平的影響:在體外連續(xù)培養(yǎng)3天后，在GnRH(10－7mol/L)作用下，恒河猴睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌水平與共培養(yǎng)的支持細(xì)胞數(shù)量有明顯的線性關(guān)系，并出現(xiàn)增加支持細(xì)胞共培養(yǎng)的數(shù)量，睪酮的分泌量就增多的趨勢，結(jié)果如圖1所示。

2．卵泡刺激素(FSH)對睪酮分泌水平的影響:體外共培養(yǎng)的恒河猴睪丸細(xì)胞，在連續(xù)培養(yǎng)3天后，加入卵泡刺激素(100ng/ml)，對睪酮分泌水平的影響，分離后的間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，在FSH作用下，產(chǎn)生睪酮分泌水平，與共培養(yǎng)的支持細(xì)胞的數(shù)量有明顯關(guān)系，以含有105個共培養(yǎng)的支持細(xì)胞組別最為顯著。結(jié)果如圖2所示。

3．表皮生長因子(EGF)對睪酮分泌水平的影響:結(jié)果表明在EGF(10－7mol/L)存在下，明顯促進(jìn)了共培養(yǎng)的恒河猴睪丸細(xì)胞分泌睪酮水平，且上升的程度與支持細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。結(jié)果如圖3所示。

圖3 EGF對睪酮分泌水平的影響

4．內(nèi)皮素－1(ET－1)對睪酮分泌水平的影響:體外共培養(yǎng)的恒河猴睪丸細(xì)胞，經(jīng)cAMP(10－5mol/L)處理24h后，加入 ET－1(10－5mol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ET－1對睪酮的分泌也有明顯的刺激作用，出現(xiàn)睪酮的分泌量隨著共培養(yǎng)的支持細(xì)胞的數(shù)量增加，有顯著的上升。結(jié)果如圖4所示。

圖4 ET－1對睪酮分泌水平的影響

5．白細(xì)胞介素－1(IL－1)對睪酮分泌水平的影響:IL－1(10－5mol/L)對共培養(yǎng)的恒河猴睪丸細(xì)胞睪酮的分泌，沒有產(chǎn)生明顯的刺激反應(yīng)，隨著共培養(yǎng)的支持細(xì)胞的數(shù)量增加，培養(yǎng)液中睪酮的分泌水平未出現(xiàn)顯著的增加趨勢。結(jié)果如圖5所示。

圖5 IL－1對睪酮分泌水平的影響

討 論

睪丸組織的支持細(xì)胞對生殖細(xì)胞具有支持和營養(yǎng)作用，構(gòu)成血睪屏障、形成睪丸內(nèi)微環(huán)境、調(diào)節(jié)精子的發(fā)生、吞噬細(xì)胞殘體、產(chǎn)生類固醇類物質(zhì)及分泌細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)生殖功能，對生殖細(xì)胞的形成起關(guān)鍵作用［3］。此外，支持細(xì)胞還有重要的免疫豁免作用。而睪丸組織的間質(zhì)細(xì)胞，分布于生精小管之間的疏松結(jié)締組織中，是睪丸間質(zhì)內(nèi)最主要的細(xì)胞。非人靈長類動物—恒河猴睪丸間質(zhì)細(xì)胞是雄激素的主要來源，雄激素的產(chǎn)生受促黃體素(LH)調(diào)節(jié)，其合成和分泌的雄激素主要是睪酮［4］。

恒河猴睪丸組織中，類黃體生成素釋放激素的主要來源支持細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞上有類黃體生成素釋放激素受體，通過類黃體生成素釋放激素與受體的結(jié)合，改變間質(zhì)細(xì)胞的通透性，進(jìn)而調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌功能［5］。由于支持細(xì)胞上有FSH的受體，間質(zhì)細(xì)胞有LH的受體，所以卵泡刺激素是通過對支持細(xì)胞的調(diào)節(jié)來增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮［6］。本研究表明，GnRH、FSH都能夠明顯增加恒河猴支持細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌水平。

恒河猴支持細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)、表皮生長因子、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子等，這些因子可通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的功能［7］。EGF既能增加孕烯醇酮的合成，也能提高關(guān)鍵酶的活性來增加睪酮的合成。實驗結(jié)果表明，在EGF存在下，對共培養(yǎng)恒河猴睪丸細(xì)胞睪酮生物合成有明顯的促進(jìn)作用，且睪酮分泌水平與恒河猴睪丸的支持細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。

體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞在卵泡刺激素和cAMP作用下能釋放內(nèi)皮素－1樣免疫活性物質(zhì)，而睪丸間質(zhì)細(xì)胞含有高密度的內(nèi)皮素－1受體，內(nèi)皮素－1通過與靶細(xì)胞膜上的內(nèi)皮素受體結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)，因此，ET－1對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生理功能具有調(diào)節(jié)作用［8］。實驗證實了，在cAMP刺激下，恒河猴睪丸的支持細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮量增加，提示恒河猴睪丸支持細(xì)胞通過提高間質(zhì)細(xì)胞對LH的敏感性，促進(jìn)了間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌水平。

在人和大鼠睪丸組織中具有活性IL－1物質(zhì)，并且證明是由支持細(xì)胞釋放的［9］。在睪丸中存在IL－1自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)，從而影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生物合成。但是，關(guān)于IL－1對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用有不同的看法，而在非人靈長類動物睪丸組織的IL－1的作用并不十分清楚。IL－1α對睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮釋放有促進(jìn)效應(yīng)，并呈劑量依賴關(guān)系［10］;但也有人認(rèn)為IL－1可以影響雄激素合成中的多個步驟，可能導(dǎo)致膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450sccmRNA的表達(dá)降低，從而導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)雄激素的合成量減少［11］。本研究表明，IL－1對共培養(yǎng)的恒河猴睪丸細(xì)胞睪酮的分泌，不影響睪酮的基礎(chǔ)合成，隨著共培養(yǎng)的恒河猴睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量增加，睪酮的分泌水平未出現(xiàn)顯著的增加趨勢?？梢奍L－1對恒河猴睪酮分泌的調(diào)節(jié)是比較復(fù)雜的，IL－1的細(xì)胞信號可能不是體內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞功能或睪酮合成所必需的。

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