王 鵬，許 潔，李 昕，于 順，何 欣

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林化工學(xué)院理學(xué)院，吉林 吉林132022；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京老年病研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053）

α－突觸核蛋白功能片段對(duì)原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元突起的促生長(zhǎng)作用

王 鵬1，許 潔2，李 昕3，于 順3，何 欣1

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林化工學(xué)院理學(xué)院，吉林 吉林132022；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京老年病研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053）

目的：研究人α－突觸核蛋白（α－Syn）對(duì)原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元突起的促生長(zhǎng)作用，闡明該蛋白質(zhì)的功能片段，并探討其作用機(jī)制。方法：獲取新生Wistar大鼠大腦皮層神經(jīng)元分組培養(yǎng)，分別加入α－Syn（添加α－Syn組）、α－Syn功能片段N端（添加N端組）、C端（添加C端組）和NAC段（添加NAC段組），對(duì)照組不添加功能片段。倒置相差顯微鏡觀察各組神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度，Western blotting法、免疫熒光法特異性鑒定各組α－Syn蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：在生長(zhǎng)至1和2 h，添加C端組和α－Syn組的神經(jīng)元突起平均長(zhǎng)度長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05），而添加NAC段組和N端組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；生長(zhǎng)至4 h，添加α－Syn組和C端組的神經(jīng)元突起平均長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.01），而添加NAC段組和N端組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Western blotting和免疫熒光法檢測(cè)，N端和C端可以進(jìn)入神經(jīng)元，NAC段不能進(jìn)入神經(jīng)元。結(jié)論：α－Syn在原代神經(jīng)元生長(zhǎng)初期對(duì)其突起生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，具有這一功能的片段位于C端，其機(jī)制可能是其通過(guò)胞膜進(jìn)入到神經(jīng)元內(nèi)，促進(jìn)微管蛋白聚合形成微管，加速細(xì)胞骨架的形成和軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)。

突觸核蛋白；神經(jīng)元；突起生長(zhǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)；帕金森病

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)呈進(jìn)展性，目前尚無(wú)控制病程發(fā)展的有效措施。PD的病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死和路易小體及路易軸索的形成［1－2］。多項(xiàng)研究［3］表明：人α－突觸核蛋白（α－Synuclein，α－Syn）是參與形成路易小體和路易軸索的主要成分。已知α－Syn與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與突觸形成、維持和神經(jīng)元的分化，對(duì)突觸可塑性起一定作用。在PD病理中，α－Syn除了作為路易小體和路易軸索的主要成分存在于細(xì)胞間以外，尚存活多巴胺能神經(jīng)元的胞體和軸突中也有分布，特別是在軸突中分布較胞體更為密集。α－Syn是1種具有140個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［4－6］。正常情況下，α－Syn空間構(gòu)象不穩(wěn)定，但與其他蛋白質(zhì)作用后會(huì)形成比較穩(wěn)定的構(gòu)象。α－Syn功能片段包括：NAC段（第61～95位氨基酸），已被確定是α－Syn淀粉樣變和纖維化過(guò)程重要片段；N端（第1～60位氨基酸），對(duì)微管形成無(wú)作用，含有2個(gè)PD突變位點(diǎn)（30和53）；C端（第96～140位氨基酸），包含α－Syn有家族特征性信息，可促進(jìn)微管蛋白在體外合成微管［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)：α－Syn與微管蛋白之間存在分子伴侶關(guān)系；α－Syn在體外實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合，加速微管的形成。有研究［9－10］顯示：α－Syn可以調(diào)節(jié)突起發(fā)出并促進(jìn)原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元突起生長(zhǎng)。但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)α－Syn各功能片段對(duì)突起生長(zhǎng)影響的報(bào)道。本研究分離大鼠大腦皮層神經(jīng)元，進(jìn)行分組培養(yǎng)，觀察α－Syn各片段對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響，旨在確定具有促生長(zhǎng)作用的片段，探討其作用機(jī)制和PD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 新生24 h Wistar大鼠30只，雌雄不限，購(gòu)自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK－（軍）2002－001。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購(gòu)自PIERCE Biotech公司；α－Syn單克隆抗體3D5和各片段的單克隆抗體由宣武醫(yī)院神經(jīng)生物研究室制備；FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自中衫公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（F－12）購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）和馬血清（HS）購(gòu)自HyClone公司；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Pharmacia公司；其他試劑均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 蛋白的純化與定量 實(shí)驗(yàn)所用重組蛋白人α－Syn、N端（1～60）、NAC（61～95）和 C端（96～140）均采用親和層析法進(jìn)行純化。采用SDSPAGE法進(jìn)行鑒定，BCA法進(jìn)行定量。

1.3 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 將Kohn創(chuàng)建的原代培養(yǎng)方法［11－12］進(jìn)行改良。新生24 h大鼠斷頭，分離鼠腦，置于D－Hank’s緩沖液中，剝?nèi)ゴ笫笱苣X膜，分離皮層，剪碎。胰酶消化45 min后吹散，篩網(wǎng)過(guò)濾。600 r·min－1離心3 min后棄上清，細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。按每皿0.75×105個(gè)接種于培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)。

1.4 神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的觀察和長(zhǎng)度測(cè)量 培養(yǎng)至第1、2和4 h時(shí)，向培養(yǎng)皿中添加1%戊二醛。室溫下固定1 h。隨機(jī)挑選30個(gè)視野進(jìn)行拍照，要求每個(gè)視野至少有5個(gè)存活的神經(jīng)元。鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。應(yīng)用Image－Pro Plus V2.0軟件測(cè)量神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度。

1.5 Western blotting法和免疫熒光法鑒定各組蛋白表達(dá)水平 吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，沖洗。刮下細(xì)胞，超聲破碎。功率200 W，破碎30 s、2次，間歇 30 s。破 碎 后 加 入 SDS－PAGE Running Buffer，沸水中煮5 min。4°C、12000 r·min－1離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液。取上清液30μL作為樣品，進(jìn)行SDS－PAGE。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶溶液封閉，沖洗后，以1∶1000比例稀釋的相應(yīng)抗體反應(yīng)過(guò)夜。洗膜，再與1∶5000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。沖洗后，ECL法顯示條帶。將培養(yǎng)細(xì)胞以1%戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養(yǎng)皿。以含10%羊血清的PBST溶液室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1∶5000稀釋的3D5抗體1.5 m L。4°C過(guò)夜，用PBST沖洗。加入1∶500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37°C、2 h；吸棄反應(yīng)液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

1.6 神經(jīng)元分組培養(yǎng) 向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加α－Syn、N 端、NAC 段 和 C 端，至 濃 度 為20 mol·L－1。培養(yǎng)至第1、2和4 h進(jìn)行觀察。同時(shí)用未添加蛋白的正常生長(zhǎng)組的神經(jīng)元作為對(duì)照組，觀察各組神經(jīng)元突起生長(zhǎng)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度以±s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組蛋白純化鑒定 經(jīng)親和層析法純化，以BCA法鑒定得到純度較高的α－Syn、NAC段、N端和C端。見(jiàn)圖1。

圖1 純化后蛋白的SDS－PAGE電泳圖Fig.1 SDS－PAGE electrophoregram of purified proteins

2.2 各組神經(jīng)元突起長(zhǎng)度 在培養(yǎng)基內(nèi)添加α－Syn和其他蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)后，培養(yǎng)至1和2 h時(shí)添加α－Syn組和C端組的神經(jīng)元突起平均長(zhǎng)度大于對(duì)照組，添加N端組、NAC段組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)至4 h時(shí)，添加α－Syn組和添加C端組神經(jīng)元突起長(zhǎng)度明顯大于對(duì)照組（P＜0.01），而添加N端組、NAC段組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。添加C端具有與添加α－Syn相似的促突起生長(zhǎng)功能，而添加NAC段和N端無(wú)促突起生長(zhǎng)功能。見(jiàn)表1和圖2。

表1 各組神經(jīng)元突起生長(zhǎng)長(zhǎng)度Tab.1 Lengths of neurites of neurons in various groups（±s，l／μm）

表1 各組神經(jīng)元突起生長(zhǎng)長(zhǎng)度Tab.1 Lengths of neurites of neurons in various groups（±s，l／μm）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

Group Length of neurite（t／h）1 2 4 Control 22.31±1.2629.56±2.0338.12±3.62 Addingα－Syn 29.67±2.54＊43.24±3.67＊62.31±3.85＊＊Adding N segment 22.62±3.1030.07±3.0237.09±2.72 Adding NAC 23.53±2.1129.27±3.5639.14±4.01 Adding C－Segment 28.46±1.73＊42.16±2.68＊61.22±3.96＊＊

2.3 各組α－Syn蛋白表達(dá)水平 添加α－Syn組神經(jīng)細(xì)胞裂解液經(jīng)Western blotting檢測(cè)，可見(jiàn)清晰條帶，α－Syn蛋白表達(dá)陽(yáng)性；添加N端組和C端組為弱陽(yáng)性；對(duì)照組、添加NAC段組未見(jiàn)條帶，α－Syn蛋白表達(dá)陰性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)，添加α－Syn組、C端組和N端組神經(jīng)元顯色清晰，在細(xì)胞內(nèi)呈廣泛、均勻分布，添加C端組和對(duì)照組為陰性。見(jiàn)圖3和4（插頁(yè)二）。

3 討 論

微管是中空管狀結(jié)構(gòu)，在胞質(zhì)中形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［13］。微管廣泛存在于各種細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞有明顯的支持和定形作用，被認(rèn)為是主要的 “細(xì)胞骨骼”。在神經(jīng)細(xì)胞的軸突和樹(shù)突中，微管束沿長(zhǎng)軸排列，起支撐作用。在胚胎發(fā)育階段，微管幫助軸突生長(zhǎng)，突入周圍組織；在成熟的軸突中，微管是物質(zhì)運(yùn)輸?shù)穆奋?，參與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。神經(jīng)元生長(zhǎng)的特點(diǎn)之一是突起（軸突和樹(shù)突）自身缺乏合成蛋白的能力，其再生所需的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)由胞體合成后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離的轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)軸突末梢，而擔(dān)任此重要功能的物質(zhì)之一即是微管，同時(shí)軸突的形成和徑向生長(zhǎng)也與微管密切相關(guān)。外源性α－Syn以某種尚未明確的方式進(jìn)入到原代培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)［9］，其能夠與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白聚合形成微管，既可以穩(wěn)定突起形態(tài)，又能夠加速軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)，從而可以使神經(jīng)元突起生長(zhǎng)加速。這一作用提示該蛋白很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育階段神經(jīng)元突起的形成和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。α－Syn的變異體A53T和A30P不具備微管有序組裝功能，對(duì)突起生長(zhǎng)無(wú)影響。本文作者認(rèn)為：在家族PD患者的腦神經(jīng)元受到某種致病因子損傷后，由于伴侶蛋白的突變，影響微管的合成和有序排列，致使神經(jīng)元突起修復(fù)和重建障礙或軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，導(dǎo)致無(wú)定 形物的合成，這是PD發(fā)病原因之一。

圖2 鏡下各組神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度（×40）Fig.2 Lengths of neurites of neurons in various groups under microscope（×40）

圖3 Western blotting法檢測(cè)α－Syn蛋白表達(dá)Fig.3 The expressions of α－Syn proteins detected by Western blotting method

Alim等［7］發(fā)現(xiàn)：α－Syn與微管蛋白在結(jié)構(gòu)上存在著伴侶關(guān)系；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：微管蛋白對(duì)α－Syn纖維化聚合有啟動(dòng)和促進(jìn)作用；α－Syn和微管蛋白共同分布在PD患者的病灶區(qū)域。Alim等［8］發(fā)現(xiàn)：α－Syn可以促進(jìn)微管蛋白聚合組裝成微管，并證實(shí)這一功能片斷在α－Syn的C末端。這些發(fā)現(xiàn)也支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示：α－Syn可以進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，其作用片段位于C端。整個(gè)α－Syn分子含有7個(gè)KTKEGV不完全重復(fù)序列，該序列能夠介導(dǎo)α－Syn通 過(guò)細(xì) 胞 膜［14－15］。其 N 端 含 有 4 個(gè) 重 復(fù) 的KTKEGV殘基，且含有極性的螺旋，能與載脂蛋白結(jié)合，進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)部，引起Western blotting和免疫熒光印跡的陽(yáng)性反應(yīng)；但添加N端并沒(méi)有促進(jìn)突起生長(zhǎng)的功能。而添加NAC段則不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不能在突起內(nèi)部促進(jìn)微管骨架的合成，也不具有促突起生長(zhǎng)的功能。失去穿梭能力可能是NAC成為PD患者腦組織間淀粉樣變性的主要原因。α－Syn與微管蛋白之間的共同作用關(guān)系目前已成為PD病因的研究熱點(diǎn)。

［1］Forno LS.Neuropathology of Parkinson’s disease［J］.Neuropathol Exp Neurol，1996，55（3）：259－272.

［2］Spillantini MG，Crowther RA，Jakes R，et al.alpha－Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with lewy bodies［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1998，95（11）：6469－6473.

［3］Zarranz JJ，Alegre J，Gomez－Esteban JC，et al.The new mutation E46K of alpha－synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia［J］.Ann Neurol，2004，55（2）：164－173.

［4］Maroteaux L，Campanelli JT，Scheller RH.Synuclein：a neuronspecific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal［J］.Neuroscience，1988，8（8）：2804－2815.

［5］Polymeropoulos MH，Higgins JJ，Golbe LI，et al.Mapping of a gene for Parkinson’s disease to chromosome q21－q23［J］.Science，1996，274（5290）：1197－1199.

［6］Kruger R，Muller T，Riess O.Involvement of alphasynuclein in Parkinson’s disease and other neurodegenerative disorders［J］.Neural Transm，2000，107（1）：31－40.

［7］Alim MA，Qiu LM，Kazuya T.Demonstration of a role for synuclein as a functional microtubule－associated protein［J］.J Alzheimer’s Dis，2004，6（4）：435－442.

［8］Alim MA，Hossain MS，Arima K.Tubulin seeds synuclein fibril formation［J］.J Biol chem，2002（277）：2112－2117.

［9］劉光偉，王 鵬，李堯華，等.α－突觸核蛋白促進(jìn)大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（5）：607－610.

［10］Lee HJ，Lee K，Im H.alpha－Synuclein modulates neurite outgrowth by interacting with SPTBN1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，424（3）：497－502.

［11］Kohn JY.Quantitative determination of glutamate－mediated cortical neuronal injury in cell by lactate dehydrogenase efflux assay［J］.J Neurosci Methods，1987，20（1）：82.

［12］鄧小云，楊 眉，蔡 芳，等.一種改進(jìn)的原代神經(jīng)元的制備方法［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2005，4（2）：145－149.

［13］Meloni MA，Galleri G，Camboni MG.Modeled microgravity affects motility and cytoskeletal structures［J］.Gravit Physiol，2004，11（2）：197－198.

［14］Bussell R Jr，Eliezer D.A structural and functional role for 11－mer repeats in alpha－synuclein and other exchangeable lipid binding proteins［J］.J Mol Biol，2003，329（4）：763－778.

［15］Keun JA，Seung RP，Kwang CC，et al. Amino acid sequence motifs and mechanistic features of the membrane translocation of α－synuclein［J］.J Neurochem，2006，97（1）：265－279.

Growth－promoting effect ofα－Synuclein function fragment on neurites of primary cultured neurons of rats

WANG Peng1，XU Jie2，LI Xin3，YU Shun3，HE Xin1
（1.Department of Human Anatomy，School of Basic Medical Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China；2.College of Science，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；3.Research Room of Neurobiology，Beijing Institute of Geriatrics，Xuanwu Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Objective To study the growth－promoting effect ofα－Synuclein（α－Syn）function fragment on neurites of primary cultured neurons of rats and to clarify its physiological function fragment and to explore its mechanism.Methods The neurons in neocortex of newborn SD rats were cultured in various groups.Theα－syn（addingα－Syn group）and its function segments such as N segment（adding N segment group），C segment（adding C segment group）and NAC segment（adding NAC segment group）were added into the neural cells，and no protein was added into control group.The lengths of neurites of neurons were observed with inverted phase contrast microscope.Western blotting and immunofluorescence staining assay were used to confirm the expression levels of proteins in various groups.Results 1 and 2 h after culture，the average lengths of neurites in adding C segment group and addingα－Syn group were longer than that in control group（P＜0.05）；the average lengths of neuites in adding NAC and N segment groups had no significant differences compared with control group（P＞0.05）.4 h after culture，the average length of neurites in adding C segment group was significantly higher than that in control group（P＜0.01）；the average lengths of neuites in adding NAC and N segment groups had no significant difference compared with control group（P＞0.05）.The results of Western blotting and immunofluorescence staining assay showed that N segment and C segment could enter into the neuron，but NAC could not enter into the neuron.Conclusion α－Syn can enhance the outgrowth of neurite of primarily cultured neuron.The C segment ofα－Syn has the potential to enhance neurite outgrowth，and its possible mechanism may be that C segment ofα－Syn can enter into the neuron，and polymerize tubulin into microtubule，and accelerate the formation of cytoskeleton and axoplasmic transporting.

α－Synuclein；neuron；neurite outgrowth；cell culture；Parkinson’s disease

R741

A

2012－06－07

吉林省教育廳 “十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助課題（吉教科合字［2012］第137號(hào)）

王 鵬（1977－），男，吉林省吉林市人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事人體解剖學(xué)基礎(chǔ)理論和老年病神經(jīng)生物學(xué)研究。

何 欣（Tel：0432－64608003；E－mail：hexin8040＠163.com）

1671－587Ⅹ（2012）06－1101－05