吳 靜，付海英，張英林，孫際童，楊 巍

（1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春130021）

DNA－PKcs協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Toll樣受體的表達(dá)及其意義

吳 靜1，2，付海英1，張英林1，孫際童1，楊 巍1

（1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春130021）

目的：探討小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)DNA－PKcs協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)控Toll樣受體（TLRs）的表達(dá)水平，闡明外周免疫系統(tǒng)中自身免疫調(diào)節(jié)因子的調(diào)控作用及其意義。方法：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為pEGFPC1／m Aire轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1／m Aire與negative control siRNA共轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1／m Aire與DNA－PKcs siRNA共轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1與negative control siRNA共轉(zhuǎn)染組和pEGFPC1與DNA－PKcs siRNA共轉(zhuǎn)染組，采用RT－PCR方法檢測各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR1～9的表達(dá)水平；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p EGFPC1／m Aire和空載質(zhì)粒p EGFPC1至小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用RT－qPCR方法檢測2組細(xì)胞TLR1～9的表達(dá)水平；采用RT－qPCR方法檢測2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默DNA－PKcs前后TLRs的表達(dá)水平。結(jié)果：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能表達(dá)TLR1～9；與轉(zhuǎn)染pEGFPC1／m Aire組細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染自身免疫調(diào)節(jié)因子后巨噬細(xì)胞TLR1、3和8的表達(dá)水平增加（P＜0.05），其他組TLRs表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）；DNA－PKcs沉默后，轉(zhuǎn)染pEGFPC1／m Aire組細(xì)胞TLR1、3和8的表達(dá)水平較未沉默組明顯下降（P＜0.05），而在轉(zhuǎn)染p EGFPC1的細(xì)胞內(nèi)DNA－PKcs沉默前后TLR1－9表達(dá)水平均無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論：在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)，自身免疫調(diào)節(jié)因子能夠調(diào)控TLR1、3和8的表達(dá)，其機(jī)制可能與DNA－PKcs協(xié)同作用有關(guān)。

自身免疫調(diào)節(jié)因子；巨噬細(xì)胞；Toll樣受體；協(xié)同分子

自身免疫調(diào)節(jié)因子（autoimmune regulator，Aire）作為一個重要的轉(zhuǎn)錄激活子，主要表達(dá)于胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞（medullar thymic epithelial cells，m TECs），調(diào)節(jié)許多外周組織自身抗原（peripheral tissue self－antigen，PTA）的 表 達(dá)［1］，從而誘導(dǎo)中樞耐受。此外，在外周組織中也存在自身免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，包括外周淋巴器官、胎兒的肝 臟、 睪 丸 和 卵 巢［2－3］。Suzuki等［4］研 究 顯 示：在外周血CD14＋樹突狀細(xì)胞（dentritic cell，DC）、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和B細(xì)胞中可檢測到自身免疫調(diào)節(jié)因子基因的表達(dá)。目前，雖然自身免疫調(diào)節(jié)因子在胸腺中的功能較為明確，但其在外周的意義尚不清楚。本課題組前期研究［5］結(jié)果顯示：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染自身免疫調(diào)節(jié)因子的小鼠巨噬樣細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，自身免疫調(diào)節(jié)因子能夠上調(diào)Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）1、TLR3和TLR8的表達(dá)，但是自身免疫調(diào)節(jié)因子在正常細(xì)胞內(nèi)是否具有相同的作用以及其影響TLR1、3、8表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。許多研究［6］表明：自身免疫調(diào)節(jié)因子不是一個經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子［1］，其需與其他蛋白相互協(xié)作進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)［1，7－8］，如DNA 依 賴 的 蛋 白 酶（DNA－dependent protein kinase，DNA－PK）是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，屬于磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）家族成員，以一種全酶的形式存在，包括2個調(diào)節(jié)亞單位Ku70，Ku80和1個大的催化亞單位—正DNA－蛋白激酶（catalytic sunbunit of the DNA－dependent protein kinase，DNA－PKcs）。DNA－PKcs能夠正向或負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［9－10］。本研究旨在探討在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)DNA－PKcs是否能夠與自身免疫調(diào)節(jié)因子相互作用促進(jìn)TLRs的表達(dá)，為研究自身免疫調(diào)節(jié)因子在外周的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 BALB／c小鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，合格證號：SCXK吉2003－001。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司，USA），胎牛血清（杭州四季清公司），胰酶（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），瓊脂糖（廈門百維信生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara公司，日本），TransFast Taq聚合酶、DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司），2.5 mmol·L－1d NTP、Oligod T（天根生物試劑有限公司），PCR引物（上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。

1.2 siRNA的合成和轉(zhuǎn)染 siRNA是由廣州銳博生物（RiboBio公司，中國）設(shè)計合成。采用RT－qPCR方法檢測到了最有效的一對siRNA（si－m－Prkdc－003）應(yīng)用于后續(xù)實驗的研究。si－m－Prkdc－003 的 序 列 如 下：Sense，5′－GGAUCGAGCUGUUCAGAAA d Td T－3′； Anti－sense，3′－d Td T CCUAGCUCGACAAGUCUUU－5′。先向12孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，融合度達(dá)到40%～60%，24 h后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換新的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)48或72 h后，收集細(xì)胞，采用RT－qPCR方法檢測DNA－PKcs的沉默效率。

1.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)染 BALB／c小鼠腹腔內(nèi)注射1 m L 3%淀粉，第4天用8 m L PBS沖洗腹腔，收集腹腔液并離心后重懸于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，并接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)（4×105m L－1）。37°C培養(yǎng)3 h后，用培養(yǎng)液洗去未黏附的細(xì)胞，黏附的細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將p EGFPC1／m Aire或p EGFPC1質(zhì)粒（由本室構(gòu)建并保存）分別轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。DNA－PKcs沉默時，將p EGFPC1／m Aire細(xì)胞分為p EGFPC1／m Aire轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1／m Aire與 negative control siRNA共轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1／m Aire與DNA－PKcs siRNA共轉(zhuǎn)染組，將p EGFPC1細(xì)胞分為p EGFPC1轉(zhuǎn)染組、p EGFPC1與negative control siRNA共轉(zhuǎn)染組，p EGFPC1與 DNA－PKcs siRNA 共轉(zhuǎn)染組，48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.4 RT－PCR 與 RT－qPCR 采 用 RNAisoTMPLUS（Takara公司，Japan）提取總 RNA。以1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件為30℃、10 min；42℃、60 min；70℃、15 min，4℃、10 min，1個循環(huán)。TLRs的引物序列見文獻(xiàn)［5］。DNA－PKcs的引物序列：Sense，5′－ATTGCTGTATCAAGGCTCA－3′；Antisense，5′－ACACTTCCTCCAGTTCTGC－3′。PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃、2 min；95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，72℃、10 min，共35個循環(huán)。qPCR的反應(yīng)條件：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環(huán)；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，1個循環(huán)。用ABI PRISM7300檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems公司，USA）進(jìn)行檢測。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測siRNA沉默效率 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染青色素染料（Cy3）熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)染對照siRNA。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收細(xì)胞，PBS洗3遍，1000 r·min－1離心5 min，用4%的多聚甲醛重懸細(xì)胞以備上機(jī)檢測，以未轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞做為對照，Cy3陽性細(xì)胞比率即為沉默效率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs和DNA－PKcs表達(dá)水平以±s表示，組間比較采用Student’s t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)水平 采用RT－PCR方法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR1～9的表達(dá)水平，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR1～9。見圖1。

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR1～9表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of TLR1－9 in peritoneal macrophages of mice

2.2 自身免疫調(diào)節(jié)因子作用后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs表達(dá)水平 采用RT－qPCR方法檢測瞬時轉(zhuǎn)染自身免疫調(diào)節(jié)因子的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR1～9 mRNA 表 達(dá) 水 平。p EGFPC1／m Aire轉(zhuǎn) 染 組TLR1、TLR3和TLR8的表達(dá)水平均較轉(zhuǎn)染p EGFPC1組增加（P＜0.05），而其他組TLRs的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染p EGFPC1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1

表1 自身免疫調(diào)節(jié)因子作用后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上TLR1～9的表達(dá)水平Tab.1 The expression levels of TLR1－9 in peritoneal macrophages in mice after treated with Aire （±s）

表1 自身免疫調(diào)節(jié)因子作用后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上TLR1～9的表達(dá)水平Tab.1 The expression levels of TLR1－9 in peritoneal macrophages in mice after treated with Aire （±s）

＊P＜0.05 vs p EGFPC1 group.

Group TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 p EGFPC1 1.03±0.03 1.00±0.11 1.01±0.06 1.02±0.02 1.21±0.10 pEGFPC1／m Aire 1.77±0.05＊ 1.37±0.04 1.87±0.08＊ 1.03±0.03 1.00±0.09 Group TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 pEGFPC1 1.01±0.13 1.07±0.05 1.00±0.10 1.09±0.05 p EGFPC1／m Aire 1.06±0.09 0.94±0.20 1.87±0.06＊1.31±0.06

2.3 DNA－PKcs協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子作用后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)水平 siRNA的轉(zhuǎn)染效率能夠達(dá)到71%（圖2）。采用RT－qPCR方法檢測DNA－PKcs和TLR1～9 mRNA的表達(dá)水平，在瞬時轉(zhuǎn)染p EGFPC1／m Aire和p EGFPC1的巨噬細(xì)胞中，DNA－PKcs沉默組較negative control組DNA－PKcs的表達(dá)水平明顯下調(diào)。pEGFPC1／m Aire瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在DNA－PKcs沉默后，TLR1、TLR3和TLR8的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，而在p EGFPC1瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，TLR1、TLR3和TLR8的表達(dá)水平無明顯變化。TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和 TLR9表達(dá)水平在2組細(xì)胞內(nèi)均無明顯變化。見表2～4。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率Fig.2 The siRNA transfection efficiency detected by FCM

表2 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1和p EGFPC／m Aire巨噬細(xì)胞中DNA－PKcs mRNA的表達(dá)水平Tab.2 The expression levels of DNA－PKcs mRNA in p EGFPC1 and p EGFPC1／m Aire macrophages after DNAPKcs silence （±s）

表2 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1和p EGFPC／m Aire巨噬細(xì)胞中DNA－PKcs mRNA的表達(dá)水平Tab.2 The expression levels of DNA－PKcs mRNA in p EGFPC1 and p EGFPC1／m Aire macrophages after DNAPKcs silence （±s）

＊P＜0.01 vs negative control siRNA group.

Group pEGFPC1 pEGFPC1／m Aire Negative control siRNA 1.00±0.03 1.00±0.12 DNA－PKcs siRNA 0.52±0.12＊ 0.51±0.04＊

表3 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1／m Aire巨噬細(xì)胞TLR的表達(dá)水平Tab.3 The expression levels of TLR in pEGFPC／m Aire macrophages after DNA－PKcs silence （±s）

表3 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1／m Aire巨噬細(xì)胞TLR的表達(dá)水平Tab.3 The expression levels of TLR in pEGFPC／m Aire macrophages after DNA－PKcs silence （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control siRNA group.

Group TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 Negative control siRNA 1.01±0.05 1.00±0.06 1.02±0.08 1.21±0.10 1.01±0.14 pEGFPC1／m Aire 1.00±0.08 0.98±0.03 1.00±0.10 1.19±0.07 1.00±0.14 DNA－PKcs siRNA 0.43±0.08＊＊ 0.83±0.15 0.49±0.05＊ 1.20±0.04 1.11±0.17 Group TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 Negative control siRNA 1.01±0.14 1.01±0.13 1.03±0.08 1.00±0.06 p EGFPC1／m Aire 1.00±0.13 0.99±0.12 1.01±0.09 0.99±0.04 DNA－PKcs siRNA 0.97±0.09 1.00±0.12 0.53±0.10＊1.09±0.14

表4 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1巨噬細(xì)胞TLR的表達(dá)水平Tab.4 The expression levels of TLR in p EGFPC macrophages after DNA－PKcs silence （±s）

表4 DNA－PKcs沉默后p EGFPC1巨噬細(xì)胞TLR的表達(dá)水平Tab.4 The expression levels of TLR in p EGFPC macrophages after DNA－PKcs silence （±s）

Negative control siRNA 1.01±0.06 1.00±0.10 1.00±0.10 1.00±0.09 pEGFPC1 1.00±0.07 1.00±0.05 0.99±0.03 1.00±0.04 DNA－PKcs siRNA 0.98±0.02 1.10±0.08 0.91±0.03 0.98±0.07

3 討 論

自身免疫調(diào)節(jié)因子的基因突變可導(dǎo)致自身免疫性多內(nèi)分泌腺?。钪榫。馀邔訝I養(yǎng)不良（autoimmune polyendocrinopathy－candidiasesectodermal dystrophy，APECED），主要表現(xiàn)為慢性皮膚黏膜的念珠菌病、甲狀旁腺功能減退和Addison’s?。?1］。有研究［4，12］顯示：許多蛋白能夠協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子作用調(diào)控其內(nèi)源性基因的表達(dá)。自身免疫調(diào)節(jié)因子的協(xié)同分子按功能大概分為4類：核轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和pre－mRNA加工［1］。研 究［8，13］顯 示： 一 組 蛋 白（DNA－PKcs、PARP－1、 TOP2a、 FACT、 Ku80、 Ku70 和H2AX）可能與自身免疫調(diào)節(jié)因子形成大的分子復(fù)合體，參與自身免疫調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的調(diào)控內(nèi)源性基因的表達(dá)；另外一些蛋白與自身免疫調(diào)節(jié)因子相互作用參與pre－mRNA的剪接，即為自身免疫調(diào)節(jié)因子能夠有效地加工許多PTA轉(zhuǎn)錄的原因。

DNA－PKcs能夠被斷裂的DNA雙鏈激活，并且在其重組過程中發(fā)揮重要作用［9，14］。DNA－PKcs能夠磷酸化許多參與轉(zhuǎn)錄過程中的蛋白，例如RNA聚合酶Ⅱ（Pol－Ⅱ）、Fos、Jun和TATA盒結(jié)合蛋白（TATA binding protein，TBP）等［14］。Liiv等［7］采用pull－down實驗檢測轉(zhuǎn)染自身免疫調(diào)節(jié)因子的單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：DNA－PKcs能夠與自身免疫調(diào)節(jié)因子相互作用，并且進(jìn)一步采用廣泛的質(zhì)譜分析證實了這一點。體外研究［7］也表明：DNAPKcs能夠磷酸化自身免疫調(diào)節(jié)因子并且影響自身免疫調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄激活能力。本研究結(jié)果顯示：在原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)，自身免疫調(diào)節(jié)因子能夠調(diào)控TLR1、3和8表達(dá)。DNA－PKcs沉默后，p EGFPC1／Aire瞬時轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞內(nèi)的TLR1、3和8表達(dá)水平下調(diào)，因此DNA－PKcs可能協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR1、3和8的表達(dá)，由此推測在巨噬細(xì)胞內(nèi)DNA－PKcs可能通過磷酸化自身免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)而促進(jìn)TLR1、3和8的表達(dá)，但確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實。

表達(dá)在外周淋巴器官的DC和單核／巨噬細(xì)胞上的TLR1、3和8不僅發(fā)揮著模式識別受體的作用，即識別和清除病原微生物，而且還通過特殊的機(jī)制發(fā)揮免疫耐受作用。有研究［15］顯示：TLR3通過調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素、IL－10、IL－27、吲哚胺2和3－雙加氧酶（indoleamine2，3－dioxygenase，IDO）的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生和抑制Th17細(xì)胞以維持外周免疫耐受。本文作者推測：在巨噬細(xì)胞內(nèi)，自身免疫調(diào)節(jié)因子可能通過調(diào)節(jié)TLR1、3和8的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生以發(fā)揮維持外周免疫耐受的作用，在此過程中，DNA－PKcs作為一個協(xié)同分子發(fā)揮著十分重要的作用。此外，表達(dá)在DC和巨噬細(xì)胞上的TLR3作為模式識別受體，能夠識別真菌，特別是白色念珠菌［15］。因此本文作者推測：自身免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)TLR3的表達(dá)可以起到抵抗真菌免疫的作用。

綜上所述，自身免疫調(diào)節(jié)因子能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR1、3和8的表達(dá)，并且DNA－PKcs能夠協(xié)同自身免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮這一作用，提示DNA－PKcs與自身免疫調(diào)節(jié)因子相互作用調(diào)控巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)，這一作用對介導(dǎo)其識別病源微生物和維持外周免疫耐受發(fā)揮著重要的作用。

［1］Abramson J，Giraud M，Benoist C，et al.Aire’s partners in the molecular control of immunological tolerance［J］.Cell，2010，140（1）：123－135.

［2］Kogawa K，Nagafuchi S，Katsuta H，et al.Expression of AIRE gene in peripheral monocyte／dendritic cell lineage［J］.Immunol Lett，2002，80（3）：195－198.

［3］Schaller CE，Wang CL，Beck－Engeser G，et al.Expression of Aire and the early wave of apoptosis in spermatogenesis［J］.J Immunol，2008，180（3）：1338－1343.

［4］Suzuki E，Kobayashi Y，Kawano O，et al.Expression of AIRE in thymocytes and peripheral lymphocytes［J］.Autoimmunity，2008，41（2）：133－139.

［5］Zhu W，Yang W，He Z，et al.Overexpressing autoimmune regulator regulates the expression of toll－like receptors by interacting with their promoters in RAW264.7 cells［J］.Cell Immunol，2011，270（2）：156－163.

［6］Mathis D，Benoist C.Aire［J］.Annu Rev Immunol，2009，27（3）：287－312.

［7］Liiv I，Rebane A，Org T，et al.DNA－PK contributes to the phosphorylation of AIRE：importance in transcriptional activity［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1783（1）：74－83.

［8］Ju BG，Lunyak VV，Perissi V，et al.A topoisomeraseⅡβmediated dsDNA break required for regulated transcription［J］.Science，2006；312（5781）：1798－1802.

［9］Zhang S，Schlott B，Gorlach M，et al.DNA－dependent protein kinase（DNA－PK）phosphorylates nuclear DNA helicaseⅡ／RNA helicase A and hnRNP proteins in an RNA－dependent manner［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（1）：1－10.

［10］Giffin W，Gong W，Schild－Poulter C，et al.Ku antigen－DNA conformation determines the activation of DNA－dependent protein kinase and DNA sequence－directed repression of mouse mammary tumor virus transcription［J］.Mol Cell Biol，1999，19（6）：4065－4078.

［11］Finnish－German APECED Consortium. An autoimmune disease，APECED，caused by mutations in a novel gene featuring two PHD－type zinc－finger domains［J］.Nat Genet，1997，17（4）：399－403.

［12］Halonen M，Kangas H，Ruppell T，et al.APECED－causing mutations in AIRE reveal the functional domains of the protein［J］.Hum Mutat，2004，23（3）：245－257.

［13］Heo K，Kim H，Choi SH，et al.FACT－mediated exchange of histone variant H2AX regulated by phosphorylation of H2AX and ADP－ribosylation of Spt16［J］.Mol Cell，2008，30（1）：86－97.

［14］Smith GC，Jackson SP. The DNA－dependent protein kinase［J］.Genes Dev，1999，13（8）：916－934.

［15］Romani L.Immunity to fungal infections［J］.Nat Rev Immunol，2011，11（4）：275－288.

Expression of Toll like receptor regulated by DNAPKcs and autoimmune regulator in peritoneal macrophages in mice and its significance

WU Jing1，2，F(xiàn)U Hai－ying1，ZHANG Ying－lin1，SUN Ji－tong1，YANG Wei1
（1.Department of Immunology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Institute of Translational Medicine，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To study the expression levels of the Toll like receptor（TLRs）regulated by DNA－PKcs and autoimmune regulator in peritoneal macrophages in mice，and to clarify the function and significance of autoimmune regulator in peripheral immune system.Methods The macrophages were divided into p EGFPC1／m Aire transfection group，p EGFPC1／m Aire and negative control siRNA co－transfection group，p EGFPC1／m Aire and DNA－PKcs siRNA co－transfection group，p EGFPC1 and negative control siRNA co－transfection group，and p EGFPC1 and DNA－PKcs siRNA co－transfection group；the expression levels of TLR1－9 in peritoneal macrophages of the mice in various groups were detected by RT－PCR.The expression levels of TLR1－9 in peritoneal macrophages were detected by RT－qPCR after transfected with p EGFPC1／m Aire and pEGFPC1 into the peritoneal macrophages in mice；the expression levels of TLRs in the transfected cells before and after silencing DNA－PKcs were detected by RT－qPCR.Results The peritoneal macrophages in mice could express TLR1－9.Compared with p EGFPC1／m Aire transfection group，the expression levels of TLR1，3 and 8 were increased in peritoneal macrophages after transfected with autoimmune regulator（P＜0.05）and those in the other groups did not changed significantly（P＞0.05）.After silencing DNA－PKcs，the expression levels of TLR1，3，and 8 were decreased（P＜0.05）in peritoneal macrophages in p EGFPC1／m Aire transfection group than thoes in unsilenced group，but the expression levels of TLR1－9 didn’t have significant changes in macrophages transfected with p EGFPC1 before and after silence（P＞0.05）.Conclusion Autoimmune regulator can regulate the expression levels of TLR1，3，and 8 in peritoneal macrophages in mice，and the mechnism may be associated with DNA－PKcs interaction effect.

autoimmune regulator；macrophages；Toll－like receptor；partner

R392.12

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1063－05

2012－07－12

國家自然科學(xué)基金資助課題（81001304）

吳 靜（1980－），女，吉林省白山市人，醫(yī)學(xué)博士，主要從事免疫耐受機(jī)制方面的研究。

楊 ?。═el：0431－85619476，E－mail：ywei＠jlu.edu.cn）