韓曉紅，張春玲，劉 鵬，宋媛媛，姚嘉瑞，秦 燕，唐 樂(lè)，張淑香，李 丹，馮 云，石遠(yuǎn)凱

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所內(nèi)科，北京 100021)

化療是目前治療腫瘤的主要手段之一，但化療藥物造成的不良反應(yīng)如骨髓抑制等不僅給患者增加了感染、出血等風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還直接影響了化療的順利進(jìn)行。

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)是一種防治腫瘤化放療引起的中性粒細(xì)胞減少癥的有效藥物，它與表達(dá)在中性粒細(xì)胞及其祖細(xì)胞表面的高親和性、特異性受體結(jié)合，促進(jìn)粒細(xì)胞系的造血干細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)骨髓中成熟的中性粒細(xì)胞向外周血釋放，同時(shí)刺激造血干細(xì)胞向外周血釋放［1］。但因rhG-CSF易被酶水解和腎臟清除，在體內(nèi)半衰期短，需每日給藥，重復(fù)注射不僅增加了患者的痛苦，也會(huì)引起一些不良反應(yīng)。目前，為了解決這些問(wèn)題，降低酶解機(jī)會(huì)，增加穩(wěn)定性，延長(zhǎng)血漿消除半衰期，減小血藥濃度波動(dòng)，許多藥品研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了大量長(zhǎng)效rhG-CSF制劑的研究，部分制劑已上市，如美國(guó)Amgen公司生產(chǎn)的PEG-rhG-CSF(商品名Neulasta)。

北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研發(fā)的PEG-rhGCSF制劑，通過(guò)基因重組技術(shù)在大腸埃希菌表達(dá)并純化rhG-CSF，以分子質(zhì)量為20 ku的PEG共價(jià)修飾后制成制劑。經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)(臨床研究批件號(hào):2009L01505)，在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院開(kāi)展Ⅰ期臨床研究。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 聚乙二醇重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液(PEG-rhG-CSF，規(guī)格:1.0 g·L－1/支，批號(hào):20090401，由北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制)，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF，規(guī)格:150 mg·L－1/支，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司生產(chǎn))。Human G-CSF ELISA試劑盒，美國(guó)R＆D Systems。超純水處理系統(tǒng)(型號(hào):MILLIQ)，美國(guó)密理博公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):680型)，美國(guó)伯樂(lè)公司;血細(xì)胞分析儀(型號(hào):XT-1800i)，日本希森美康;流式細(xì)胞儀(型號(hào):FACSCalibur)，美國(guó)BD公司;全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào):Modular P-800)，瑞士羅氏公司。

1.2 受試患者入選標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的腫瘤患者;KPS評(píng)分≥60，年齡18～75歲，男女不限，預(yù)計(jì)生存期3個(gè)月以上;既往未接受過(guò)放療、化療;骨髓造血功能正常(骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)檢查示骨髓增生活躍，且未見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn));外周血常規(guī)正常，無(wú)出血傾向;無(wú)明顯心功能障礙或代謝性疾病，肝功能指標(biāo)AST、ALT、總膽紅素均在正常上限的2.5倍以?xún)?nèi)，肌酐、尿素氮均在正常上限的1.5～2倍以?xún)?nèi)，自愿受試并簽署知情同意書(shū);能遵守試驗(yàn)用藥及血液樣品采集規(guī)程。

臨床試驗(yàn)方案、臨床病例報(bào)告表、知情同意書(shū)等均取得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院GCP中心倫理委員會(huì)審批并備案。

1.3 受試者一般情況 入組受試患者共24例，其中14例男性，10例女性，中位年齡為57歲(34歲～69歲)，23例非小細(xì)胞肺癌患者，1例鼻咽癌患者(Tab 1)。

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Characteristic Group 60 μg·kg－1100 μg·kg－1150 μg·kg －1 Sex Male 5 5 4 Female 3 3 4 Age(years)Mean 54.3 52.8 59.1 Median 57.5 52.5 58 SD 7.1 9.9 4.5 Range 41～62 34～69 53～67 Baseline ANC(×109cells·L－1)Mean 5.66 4.75 5.30 Median 5.55 4.76 5.20 SD 1.5 1.4 1.7 Range 3.69 ～8.1 2.69 ～7.36 2.95 ～8.01 Cancer type Non-small cell lung cancer 7 8 8 Nasopharyngeal cancer 1 0 0

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究為單中心、開(kāi)放性劑量遞增的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，受試患者均采用以卡鉑和紫杉醇為基礎(chǔ)的2個(gè)周期化療方案，用藥劑量分別為紫杉醇175 mg/m2，化療周期 d 1靜脈輸注3 h，卡鉑AUC 5化療周期d 1靜脈輸注30 min，21 d為一周期，兩個(gè)化療周期用藥劑量和時(shí)間相同。

第1周期化療時(shí)不用PEG-rhG-CSF或其它升白細(xì)胞藥物，但當(dāng) ANC＜0.5×109cells·L－1或ANC ＜1.0×109cells·L－1且伴有發(fā)熱時(shí)，每日1次皮下注射rhG-CSF 150 μg，至連續(xù)2次外周血白細(xì)胞數(shù)(WBC)≥10×109cells·L－1或 ANC≥5.0×109cells·L－1時(shí)停止給藥。

第2周期在化療藥物給藥結(jié)束后48 h皮下注射PEG-rhG-CSF 1次，參照費(fèi)氏遞增法，遞增劑量分別為60、100、150 μg·kg－13 個(gè)劑量組(每一劑量組受試患者8例，同一受試患者不進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，從小劑量開(kāi)始，每個(gè)劑量觀察結(jié)束后，才可進(jìn)行下一劑量。不可同時(shí)進(jìn)行2個(gè)以上劑量組的試驗(yàn)。如出現(xiàn)重度不良反應(yīng)或半數(shù)以上受試者出現(xiàn)中度不良反應(yīng)，即使未達(dá)到最大劑量，均停止試驗(yàn))。

1.5 樣本采集

1.5.1 PEG-rhG-CSF血藥濃度監(jiān)測(cè) 分別于PEG-rhG-CSF 給藥前 3 0 min(0 h)、給藥后2、4、8、12、16、24、36、48、72、96、144、216、288、360、432 h 于靜脈采血并分離血清，于－80℃冰箱保存，備測(cè)。

1.5.2 血常規(guī)及CD34+檢查 血細(xì)胞分析儀測(cè)定血常規(guī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞，第一周期化療期間從化療d 2起隔日檢查血常規(guī)，直到化療周期的d 20結(jié)束。第2周期化療期間從化療d 2起每日定時(shí)檢查血常規(guī)(含ANC)及CD34+細(xì)胞，至d 14(其中d 3注射PEG-rhG-CSF后12 h加測(cè)一次血常規(guī)及CD34+細(xì)胞)，以后隔日檢查一次直到化療周期的d 20結(jié)束。

1.5.3 血清生化指標(biāo)檢查 兩個(gè)化療周期的給藥前、化療周期中d 8、15利用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、血糖、尿素氮、血清肌酐、β2微球蛋白等血清生化指標(biāo)。

1.6 血藥濃度測(cè)定 使用Human G-CSF檢測(cè)試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，進(jìn)行血清中rhG-CSF濃度檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析 用Microcal origin 8.0軟件以四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，WinNonlin 5.2.1軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，并計(jì)算AUC0-t、CL_F等參數(shù)，Excel for Windows(2007版，微軟公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)研究 本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，均符合生物樣品的測(cè)定要求，用試劑盒定量檢測(cè)血清中的 P EG-rhG-CSF濃度，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在39～2 500 ng·L－1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性。標(biāo)準(zhǔn)曲線用四參數(shù)方程進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。本試驗(yàn)最低定量限為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，即39 ng·L－1。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度(RSD%)為4.3% ～6.8%，日間精密度(RSD%)為 4 .7% ～13.3%，準(zhǔn)確度(RE%)為 －5.0% ～2.7% 。同時(shí)驗(yàn)證了血清樣本在室溫放置2 h及－20℃放置8周穩(wěn)定性均良好。血清樣品的稀釋因子范圍為5～300。用6個(gè)健康人的空白血清配制與質(zhì)控樣品相同濃度的高、中、低3個(gè)濃度樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)平行樣品考察是否存在基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示低濃度點(diǎn) RE%小于20%，中、高濃度點(diǎn) RE%均小于15%。另外該試劑盒與IL-2、IL-3、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等多種細(xì)胞因子均無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

2.2 血藥物濃度測(cè)定結(jié)果 測(cè)定各劑量組不同采血時(shí)間點(diǎn)血清中藥物濃度，繪制平均血藥濃度－時(shí)間曲線(Fig 1)。

Fig 1 The concentration-time curve of subjects after injecting different doses of PEG-rhG-CSF(±s)

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果(Tab 2)，將3個(gè)劑量組間Tmax、T12進(jìn)行比較，低、中劑量組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，低、中劑量組與高劑量間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示給藥劑量 ＜ 100 μg·kg－1，吸收速率和半衰期并未受到給藥劑量的影響，但當(dāng)給藥劑量 ＞ 100 μg·kg－1，可能是由于給藥部位及體內(nèi)的受體達(dá)到局部飽和狀態(tài)，導(dǎo)致吸收速率和半衰期延長(zhǎng)。3個(gè)劑量組間Vz_F差異較小(0.935～0.821 ml·g－1)(P＞0.05)，提示表觀分布容積并未受給藥劑量影響;3個(gè)劑量組間 A UC0-t，Cmax，CL_F 比較，低、中、高劑量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著給藥劑量的增加，AUC0-t增加，Cmax增加，CL_F 降低，提示藥物在體內(nèi)存在一定的蓄積，在當(dāng)前給藥劑量范圍內(nèi)，PEG-rhG-CSF在體內(nèi)呈現(xiàn)非線性的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

2.4 藥效學(xué)研究

2.4.1 兩個(gè)周期中ANC動(dòng)態(tài)變化 rhG-CSF是防治腫瘤化放療引起的中性粒細(xì)胞減少癥的有效藥物，通過(guò)檢測(cè)患者外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(ANC)可以初步判斷其療效。觀察各劑量組第1周期ANC變化(Fig 2)，第1周期3個(gè)劑量組ANC第1峰值均值分別為(9.0±5)、(12.7±3)、(5.8±1)×109cells·L－1，ANC 最 低點(diǎn)均值分別為(1.0 ±1)、(0.7 ±0.1)、(1 ±1)×109cells·L－1，最低點(diǎn)時(shí)間為13、11、15 d，在60 μg·kg－1劑量組有3 位患者在化療過(guò)程中出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制，注射了rhG-CSF，故ANC呈現(xiàn)雙峰變化。

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Parameter Group 60 μg·kg－1 100 μg·kg－1150 μg·kg －1 T 12/h 37.5 ±7 40.8 ±12 80.7 ±48 Tmax/h 16±10 23±7 33±8 Cmax/mg·L－1 112.41 ±61 199.49 ±75 371.5 ±145 AUC0-t/mg·h·L －1 5，593.6 ±5，435 14，651.3±12，183 23，002.5 ±6，655 Vz_F/ml·g－1 0.935 ±0.634 0.576 ±0.327 0.821 ±0.576 CL_F/μl·h－1·g－117±9 9±4 7±2

Fig 2 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 1st chemotherapy cycle(±s)

各劑量組第2周ANC均呈現(xiàn)雙峰變化(Fig 3)，3個(gè)劑量組ANC第1峰值分別為(35.0±10)、(25.2±5)、(27.4 ±11)×109cells·L－1，3 個(gè)劑量組的ANC均值最低點(diǎn)依次為(1.9±1)、(2.3±2)、(6.6 ±5)×109cells·L－1，最低點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)為 7、7、2 d，第2峰值分別為(7.8±3)、(11.0±3)、(16.7±9)×109cells·L－1。隨著給藥劑量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趨勢(shì)，各劑量組的ANC的變化與PEG-rhG-CSF呈現(xiàn)一定程度的量效關(guān)系。

對(duì)比第1周期和第2周期的ANC平均值，第2周期的第1峰值、最低值均高于第1周期，ANC最低值出現(xiàn)時(shí)間前移。

2.4.2 藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)聯(lián)合分析 第2周期各劑量組ANC與血藥濃度的動(dòng)態(tài)變化擬合圖顯示(Fig 4)，以100 μg·kg－1為例，該劑量組 ANC 在化療周期的d3起開(kāi)始下降，到d7降到最低點(diǎn)，期間PEG-rhG-CSF于d 3達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始緩慢下降;在d 7～10之間ANC持續(xù)上升，d 10達(dá)第2峰，此后ANC數(shù)值維持在一個(gè)較高的水平，此時(shí)PEG-rhG-CSF的血藥濃度開(kāi)始迅速下降。血藥濃度變化與ANC值呈現(xiàn)相關(guān)性，且藥效峰值的出現(xiàn)時(shí)間滯后于血藥濃度峰值出現(xiàn)的時(shí)間，藥物的效應(yīng)與血藥濃度存在一定的滯后性。

Fig 3 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 2nd chemotherapy cycle(±s)

Fig 4 The relationship of ANC and serum drug concentration among different drug dose groups(±s)

2.4.3 外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量的變化 應(yīng)激、內(nèi)毒素、劇烈運(yùn)動(dòng)、化療和細(xì)胞因子(G-CSF、GM-CSF等)可明顯增加外周血中造血干細(xì)胞數(shù)，目前以細(xì)胞因子(G-CSF、GM-CSF)動(dòng)員居多，同時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)動(dòng)員后外周血中CD34+細(xì)胞的含量可確定采集最佳時(shí)機(jī)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PEG-rhG-CSF對(duì)外周CD34+細(xì)胞數(shù)量的影響，觀察其對(duì)造血干細(xì)胞的動(dòng)員作用(Fig 5)，在第2周期化療中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)劑量組的平均CD34+細(xì)胞達(dá)峰中位時(shí)間為d 9(9～10 d)，峰值分別為(19.7±14.2)、(30.8±15.0)和(27.6±21.2)×106cells·L－1，3 個(gè)劑量組 CD34+細(xì)胞均增高，但從變化趨勢(shì)來(lái)看，組間的量效關(guān)系并不明顯。

Fig 5 The cell numbers of peripheral blood CD34+cell among different drug dose groups(±s)

2.4.4 兩個(gè)周期血清生化指標(biāo)的變化 觀察PEG-rhG-CSF的使用是否對(duì)生化指標(biāo)有影響。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同劑量組在化療的不同時(shí)間，差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

rhG-CSF目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療各種原因引起的中性粒細(xì)胞減少癥［2－3］，同時(shí)還用于造血干細(xì)胞移植的干細(xì)胞動(dòng)員與移植后造血功能重建等。但rhG-CSF半衰期短，需要頻繁給藥，易引起不良反應(yīng)，增加了患者的痛苦。PEG化的rhG-CSF分子量增大，穩(wěn)定性提高，清除率減慢，半衰期延長(zhǎng)，作用更為持久，減少了給藥次數(shù)，減輕了患者的痛苦。

rhG-CSF在體內(nèi)可以通過(guò)腎臟和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的兩種途徑清除，但PEG-rhG-CSF分子量增大，腎小球?yàn)V過(guò)減少，中性粒細(xì)胞介導(dǎo)清除占主導(dǎo)地位［4－9］。當(dāng)ANC降低時(shí)，中性粒細(xì)胞介導(dǎo)清除過(guò)程減緩，藥物在體內(nèi)蓄積，PEG-rhG-CSF血藥濃度開(kāi)始上升，使ANC增高;而當(dāng)ANC增高時(shí)，中性粒細(xì)胞介導(dǎo)清除過(guò)程加快，血藥濃度迅速下降，ANC值維持在基線水平之上。這種自我調(diào)節(jié)大大提高了PEG-rhG-CSF在使用上的安全性。

本研究中PEG-rhG-CSF在低劑量組的平均半衰期為 37.5 h，平均清除率為 17 μl·h－1·g－1，與文獻(xiàn)報(bào)道的rhG-CSF半衰期3.37～3.5 h，清除率30 ～ 39.6 μl·h－1·g－1［6，8］相比，PEG-rhG-CSF 的半衰期明顯延長(zhǎng)，清除速率明顯減慢。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在第1周期化療過(guò)程中，受試患者均在不同程度上出現(xiàn)了骨髓抑制現(xiàn)象，其中60 μg·kg－1劑量組有3位患者在化療過(guò)程中出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制，在第2周期給予受試藥物后，無(wú)1例病人出現(xiàn)骨髓抑制現(xiàn)象，且ANC最低值出現(xiàn)時(shí)間前移，ANC最低值提高，1次注射后無(wú)重復(fù)注射，同時(shí)該P(yáng)EG-rhG-CSF(100 μg·kg－1)單次注射療效與 filgrastim(5 μg·kg－1·d－1)多次給藥的療效［5］相當(dāng)。本研究表明PEG-rhG-CSF的使用維持藥效時(shí)間長(zhǎng)、減少患者給藥次數(shù)、降低化療后出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制的發(fā)生率。結(jié)合血藥濃度、ANC變化及臨床治療需要，本研究確定100 μg·kg－1為Ⅱ期臨床研究的推薦劑量。

與其他PEG化的制劑相比較，本研究的100 μg·kg－1劑量組消除相半衰期為40.8 h、平均清除率為 9 μl·h－1·g－1，而國(guó)外臨床研究中 PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1劑量組的清除半衰期為 40.7 h，平均清除率為 12.3 μl·h－1·g－1［7］，本實(shí)驗(yàn) PEG-rhG-CSF半衰期稍有延長(zhǎng)，清除率降低明顯。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，本研究中給予PEG-rhG-CSF后，隨著給藥劑量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趨勢(shì)，各劑量組ANC的變化與PEG-rhG-CSF呈現(xiàn)一定程度的量效關(guān)系，但在國(guó)外臨床研究中［7］，ANC的變化與PEG-rhG-CSF并沒(méi)有量效關(guān)系，這可能是由于本研究中患者既往未接受過(guò)放、化療，給予兩個(gè)周期相同的化療藥物和化療劑量，而國(guó)外臨床研究的患者給予的化療方案和化療劑量各不相同，導(dǎo)致了治療反應(yīng)性的差異，影響了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

另外，本研究考察了PEG-rhG-CSF用于腫瘤患者自體外周血干細(xì)胞動(dòng)員的可行性，PEG-rhG-CSF對(duì)外周血CD34+細(xì)胞動(dòng)員效果存在明顯的個(gè)體差異，化療后動(dòng)員的 CD34+細(xì)胞以 100 μg·kg－1劑量組動(dòng)員最高，150 μg·kg－1劑量組動(dòng)員效果與國(guó)外研究中 300 μg·kg－1劑量組接近［6］，同時(shí) PEG-rhGCSF與外周血干細(xì)胞動(dòng)員不具有量效關(guān)系。因此PEG-rhG-CSF是否適用于腫瘤患者外周血干細(xì)胞動(dòng)員及其最適劑量仍有待研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PEG-rhG-CSF的效應(yīng)與血藥濃度存在一定的滯后現(xiàn)象，有研究報(bào)道，血液通常不是藥物的直接作用部位，而直接靶標(biāo)是效應(yīng)部位，通常指受體、酶和細(xì)胞膜等特異性超微結(jié)構(gòu)，所以大多數(shù)藥物效應(yīng)的變化滯后于血藥濃度的變化［11－12］，基于這種變化已有研究者將PK/PD結(jié)合模型運(yùn)用于PEG-rhG-CSF［13］和 rh-GSF［14］的研究，將劑量－濃度－效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行估算，該模型能很好的反映藥物與受體結(jié)合及藥物從體內(nèi)清除的過(guò)程，從而能夠解釋效應(yīng)與血藥濃度滯后的原因，因此PK/PD結(jié)合模型在Ⅰ期臨床研究中的意義有待研究。在今后國(guó)內(nèi)的臨床研究中，我們應(yīng)積極將PK/PD結(jié)合模型運(yùn)用在藥物臨床研究方案中，加速藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

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