湯 瑤，孫 旭，李 響，彭莉莉，李進(jìn)讓，張雙慶，聞 鎳，于 敏，李佐剛，李 波

(1.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心，北京 100176;

2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012;3.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100048)

聚乳酸(PLA)是近年來臨床實(shí)驗(yàn)中最常用的合成高分子聚合物［1－2］，已通過FDA批準(zhǔn)。對于可降解植入劑的載體材料，PLA具備良好的生物相容性，對機(jī)體無毒性和無刺激性，對組織、血液、免疫等系統(tǒng)不產(chǎn)生副作用，聚乳酸在體內(nèi)經(jīng)非酶性酯鍵隨機(jī)水解生成低聚物，最終轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2和H2O排出體外，為體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物。PLA的不對稱碳鏈為非規(guī)整結(jié)構(gòu)，有利于藥物均勻分布于基質(zhì)中，適用于藥物釋放系統(tǒng)［3－4］。

絲裂霉素 C(mitomycin C，MMC)是一種非特異性抗腫瘤抗生素，對多種實(shí)體瘤有效。MMC主要經(jīng)靜脈途徑給藥，全身化療，對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞無特異性識別，具有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及肝腎功能障礙等毒副作用［5－7］。我們將MMC與PLA制成載藥溫敏型凝膠，藥物以受控的方式從載體中釋放，然后在局部組織上發(fā)揮藥效作用，具有良好靶向性、保持藥物活性、提高透膜能力、提高生物利用度，降低其毒副作用，提高療效。

國外已有關(guān)于絲裂霉素C在動(dòng)物和人體內(nèi)的測定方法及藥代動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道［8－13］，國內(nèi)對MMC在生物基質(zhì)中的液質(zhì)聯(lián)用方法報(bào)道較少。隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域中的大量應(yīng)用［14－15］，本研究采用超高效液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)［16］，建立簡便快捷、靈敏專屬的體內(nèi)藥物分析方法，研究絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內(nèi)藥物釋放量，為絲裂霉素C的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Accela-TSQ Quantum Access超高效液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.0.7色譜工作站;LABCONCO CentriVap臺式冷凍離心濃縮儀(美國 LABCONCO公司);NEVAP112氮吹儀和OA-SYS加熱系統(tǒng)(美國Organomation Associoates公司);Mettler-Toledo AX205電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);Advantec PWU-400型超純水儀(日本Advantec公司);Eppendorf Centrifuge 5415R高速臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司);Votex Genie-2渦旋儀(美國Scientific Industries公司)。

1.2 藥品與試劑 絲裂霉素 C(Roche107409，純度98%，購自羅氏公司)，曲安奈德(批號:100055-200302，純度＞98%，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)，甲酸(色譜純，批號CDK4581，Wako公司)，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。兔空白血漿為海軍總醫(yī)院采血制備，－70℃凍存，使用前復(fù)融，離心，取上清液使用。

1.3 藥物體內(nèi)緩釋實(shí)驗(yàn)方法 成年健康新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量為2～2.5 kg(海軍總醫(yī)院動(dòng)物室)，外科手術(shù)，分離氣管前組織，對氣管外壁(約第2～5氣管環(huán))不斷搔刮至明顯充血，形成瘢痕組織。分別將0.2 ml載有不同的藥物劑量(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混勻后置于損傷后的氣管外壁，并用半圓形的硅膠管固定，逐層縫合手術(shù)切口，于給藥前和給藥后的1、3、7、10、14 和 21 d，由耳緣靜脈采血 1 ml。將取得的全血置肝素抗凝處理過的離心管中，3 000 r·min－1離心 15 min，取上層血漿，置－70℃保存，待測。

1.4 血漿樣品前處理方法 血漿室溫解凍后，精密吸取200 μl兔血漿于4.0 ml eppendorf管中，加內(nèi)標(biāo)溶液10 μl(10 mg·L－1曲安奈德甲醇溶液)，振蕩混勻，再分別加入乙酸乙酯2.2 ml，振蕩2 min，以6 000 r·min－14℃離心 5 min，取上清液 2.0 ml于40℃離心濃縮揮干后，加200 μl流動(dòng)相復(fù)溶，振蕩1 min，于7 000 r·min－14℃高速離心5 min，取上清液10 μl進(jìn)樣分析。

1.5 超高效液相色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)，預(yù)柱:Phenomenex Security Guard C18(4 mm×3.0 mm);流動(dòng)相:甲醇:0.1%甲酸水溶液=90∶10，流速:0.2 ml·min－1，等度洗脫，柱溫:35。進(jìn)樣量為 10 μl，整個(gè)分析時(shí)間為3 min。

1.6 質(zhì)譜檢測條件 離子化方式為電噴霧(ESI);選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM);檢測離子為正離子。鞘氣壓力(N2)為20 arb(3 500 kPa)，輔助氣壓力(N2)為5 arb(1.5 L·min－1)，碰撞氣壓力(Ar)1.5 mTorr(0.2 Pa)，噴霧電壓4 500 V，離子傳輸管溫度為300℃，掃描時(shí)間為 0.2 s，掃描寬度為 0.2 amu。MMC的碰撞能量(CE)為15 eV，采集離子為m/z 335.2→242.2。內(nèi)標(biāo)物曲安奈德的采集離子為m/z 435.2→415.2(8 eV)/397.3(11 eV)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)樣品和最低定量限(LLOQ) 于10支具塞離心管中加入兔空白血漿200 μl，精密加入MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血漿中 MMC濃度分別為 1，2，5，20，50，100，200，500，800，1 000 μg·L－1，按“血漿樣品前處理方法”項(xiàng)下測定，記錄樣品及內(nèi)標(biāo)峰面積，用樣品濃度對樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比作線性回歸。配制6份MMC的血漿樣品濃度為1 μg·L－1，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每一樣本的測定濃度。

1.8 準(zhǔn)確度與精密度 考察日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度與精密度(5 d)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含MMC(5，100，800 μg·L－1)低、中、高3 種濃度的含藥血漿樣品，測定后記錄峰面積比值。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得準(zhǔn)確度與精密度。

1.9 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng) 配制含MMC濃度為5，100，800 μg·L－1的血漿樣品各 6 份，按“血漿樣品前處理方法”項(xiàng)下操作，與相應(yīng)濃度的純品溶液，加入內(nèi)標(biāo)對比。測定后以提取后的色譜峰面積與相同濃度樣品未經(jīng)提取獲得的色譜峰面積之比，計(jì)算提取回收率。

取空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“血漿樣品前處理方法”項(xiàng)下操作得上清液，添加適當(dāng)濃度的MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得的峰面積和以流動(dòng)相添加MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的峰面積之比，在5，100，800 μg·L－1的3個(gè)濃度平行6份樣品評價(jià)MMC在血漿中的基質(zhì)效應(yīng)。

1.10 穩(wěn)定性考察 考察5和800 μg·L－1MMC血漿樣品在室溫放置0、2、4 h，－20℃冰箱內(nèi)冷凍保存0、6、28 d及3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 取1.0 mg·L－1的MMC和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI源正離子檢測方式下進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)和二級質(zhì)譜分析(子離子掃描，Q2掃描)，得到各自的碎片離子，進(jìn)而優(yōu)化噴霧電壓和碰撞能量，以準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度得到最大時(shí)為最佳。將UHPLC與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀連接，選擇各自的監(jiān)測離子對，再對離子傳輸管溫度、透鏡電壓、鞘氣壓、輔助氣壓等進(jìn)行優(yōu)化，使進(jìn)樣溶液中樣品的離子化效率得到最佳，得到本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜條件(見Tab 1):鞘氣壓20 arb(3 500 kPa)，輔助氣 5 arb(1.5 L·min－1)。

Tab 1中，MMC全掃描一級質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為基峰，對此峰進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，主要生成碎片離子為m/z 242.2，該碎片離子峰為［M+H］+脫去HOCONH2得到m/z 274.1碎片離子峰［M+H-HOCONH2］+，繼續(xù)脫去CH3OH得到的［M+H-HOCONH2-CH3OH］+峰，m/z 242.2碎片離子穩(wěn)定且強(qiáng)度大，為基峰。內(nèi)標(biāo)曲安奈德全掃描一級質(zhì)譜主要生成［M+H］+峰，對此峰進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，曲安奈德碎片離子較多，選擇響應(yīng)較強(qiáng)且穩(wěn)定的碎片離子，主要為:脫去HF生成m/z 415.2離子;進(jìn)一步脫水生成m/z 397.3的離子。

Tab 1 UHPLC-MS/MS parameters for mitomycin C and IS

2.2 色譜分離和專屬性 在本色譜質(zhì)譜條件下，測定乙酸乙酯萃取處理過的空白血漿樣品、添加0.5 mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液的血漿樣品、含有0.05 mg·L－1分析物和0.5 mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液的血漿樣品和兔氣管外壁給藥后采集血漿樣品，比較上述4種血漿樣品選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)下獲得的色譜圖(見Fig 1)。采用優(yōu)化后的色譜條件以及SRM方式，其專屬性強(qiáng)，靈敏度高，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物與內(nèi)標(biāo)物的測定，且內(nèi)標(biāo)物獨(dú)立出峰不干擾分析物的分離。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限(LOQ) 按“1.5”項(xiàng)下方法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007854X+0.0008116，r=0.997 7(權(quán)重系數(shù) W:1/x2)。MMC血藥濃度在1～1 000 μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)對于0.997。對于靈敏度的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度被認(rèn)為最低定量限(LLOQ)，因此MMC 的 LLOQ 為 1 μg·L－1，其日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度和精密度分別為94.88%(RSD=9.9%，n=6)和93.52%(RSD=6.9%，n=3)，此濃度下MMC的偏差小于20%，標(biāo)準(zhǔn)曲線中其它各點(diǎn)的峰面積的偏差小于15%。以定量離子對3倍信噪比(S/N)的響應(yīng)值對應(yīng)的樣品濃度作為檢出限(LOD)，因此MMC的 LOD 為 0.2 μg·L－1。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度 本方法的日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度和精密度通過分析 5，100，800 μg·L－1這 3 個(gè)濃度水平的各6個(gè)血漿樣品5 d內(nèi)得到的，分別在95.71% ～105.44%(RSD≤6.9%，n=6)和93.71% ～106.0%(RSD≤5.8%，n=5)。結(jié)果表明，準(zhǔn)確度與精密度在可接受范圍內(nèi)(±15%)，符合生物樣本測定指導(dǎo)原則的要求。

2.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) MMC在低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率分別為95.46%±3.68%、104.9% ±2.23%和92.54% ±2.64%，結(jié)果基本一致。基質(zhì)效應(yīng)分別為98.61% ±4.61%、94.95% ±2.89%和95.23% ±3.85%，沒有觀察到基質(zhì)對于離子化(離子抑制或離子增強(qiáng)現(xiàn)象)的影響，本試驗(yàn)方法可以有效排除內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾，提高靈敏度，能夠在較低的濃度水平上完成MMC的定性和定量分析。

Fig 1 Typical UHPLC-MS/MS chromatograms of mitomycin C and triamcinolone acetonide in rabbit plasma

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) MMC血漿樣品(5和800 μg·L－1)在室溫放置4 h測定結(jié)果分別為95.08% ±6.47%和100.9% ±3.26%，含量沒有下降;將血漿樣品于－20℃冰箱中分別儲存28 d，測定結(jié)果分別為98.20% ±4.29%和105.2% ±3.91%，含量沒有

出現(xiàn)變化;將血漿樣品經(jīng)歷3次凍融循環(huán)后，測定結(jié)果分別為95.94% ±3.48%和101.0% ±2.42%，含量沒有下降。結(jié)果表明，MMC在上述條件下穩(wěn)定性良好，保證了分析過程中實(shí)驗(yàn)操作的可靠性。

2.7 兔血漿樣品測試與方法應(yīng)用 將本方法應(yīng)用于兔氣管外壁給藥后血藥濃度的測定中，每組6只成年健康兔，外科手術(shù)，將0.2 ml載有(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)MMC的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混合體置于氣管外壁。于給藥后不同時(shí)間采血，從耳緣靜脈取血1 ml，測定血漿樣品中的MMC濃度(結(jié)果見Tab 2)。

Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05，0.1，0.2，0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s，n=6)

Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05，0.1，0.2，0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s，n=6)

Time point Plasma concentration/μg·L －1 0.05 mg 0.1 mg 0.2 mg 0.4 mg 0.6 mg 1 d － － － 0.11 ±0.04 0.80 ±1.4 3 d － － － 0.13 ±0.07 －7 d 0.20 ±0.24 0.56 ±0.68 0.24 ±0.15 0.41 ±0.48 0.22 ±0.04 10 d 0.42 ±0.52 0.25 ±0.19 0.18 ±0.11 0.10 ±0.08 －14 d 0.20 ±0.19 0.36 ±0.25 0.11 ±0.03 0.11 ±0.06 0.22 ±0.15 21 d － － － 0.10 ±0.05 －

3 討論

本文采用UHPLC-MS/MS方法，測定新西蘭大白兔氣管外壁給予絲裂霉素C聚乳酸凝膠后血漿內(nèi)絲裂霉素C的濃度，并對體內(nèi)可能釋放的原型藥物進(jìn)行了初步確證與定量，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析時(shí)間短等特點(diǎn)，尤其適用于大批量生物樣品測定。

本實(shí)驗(yàn)對樣品前處理方法、色譜條件及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了更有效地避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，縮短樣品前處理時(shí)間，選擇乙酸乙酯為提取溶劑并去除血漿雜質(zhì)，萃取效果好，易于分離，操作簡單且回收率高。流動(dòng)相中加入少量甲酸可以提高離子化效率，改善色譜峰形，提高靈敏度，有效排除內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)物的選擇與絲裂霉素C性質(zhì)相似，不干擾待測物的測定，并且得到良好分離。

質(zhì)譜條件選擇效應(yīng)較高的ESI源，采用正離子方式檢測，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。由一級質(zhì)譜選擇其分子離子，二級質(zhì)譜選擇其主要子離子，根據(jù)兩者子離子的色譜峰面積比定量。這種定量分析方法具有很強(qiáng)的專屬性，且定量準(zhǔn)確。

聚乳酸被用作緩、控釋系統(tǒng)的載體材料，用于半衰期短或口服生物利用度低的藥物，其優(yōu)點(diǎn)可在幾周甚至幾個(gè)月內(nèi)以一定速率釋放藥物。絲裂霉素C與聚乳酸制成凝膠制劑用于局部給藥，具有良好靶向性并保持藥物活性，而體內(nèi)緩釋且吸收量少，血液濃度低，對全身的影響不大，可預(yù)防喉氣管瘢痕組織形成并對瘢痕組織形成的抑制作用。

本文研究了絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內(nèi)釋放量，在反復(fù)摸索與調(diào)整試驗(yàn)中確定了UHPLC-MS/MS條件，通過方法學(xué)驗(yàn)證和應(yīng)用，證明該方法具有靈敏度高、操作簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但測定的絲裂霉素C含量極低，無法進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算?？赡苁怯捎诮z裂霉素C的給藥部位為氣管外壁，原型藥物難以吸收入血，因此血漿藥物濃度極低，且低于本方法的最低定量限，其結(jié)果有待于進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)，還需摸索絲裂霉素C-聚乳酸凝膠的其它給藥劑量或給藥方式，并建立更靈敏的分析方法，以探究此劑型在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為。

［1］Sinha V R，Khosla L.Bioabsorbable polymers for implantable therapeutic systems［J］.Drug Dev Ind Pharm，1998，24(12):1129－38.

［2］Mckeown S R，Cowen R L，Williams K J.Bioreductive drugs:from concept to clinic［J］.Clin Oncol，2007，19(6):427－42.

［3］Jung Y K，Lee S Y.Efficient production of polylactic acid and its copolymers by metabolically engineered Escherichia coli［J］.J Biotechnol，2011，151(1):94－101.

［4］Ho E A，Vassileva V，Allen C，Piquette-Miller M.In vitroandin vivocharacterization of a novel biocompatible polymer-lipid implant system for the sustained delivery of paclitaxel［J］.J Control Release，2005，104(1):181－91.

［5］Boku N，Ohtsu A，Muro K，et al.A case of advanced gastric cancer complicated by severe toxicity induced by a combination of tegafur，uracil and mitomycin C，and associated with abnormal pharmacokinetics［J］.Jpn J Clin Oncol，1996，26(5):379－83.

［6］Vestermark V，Havsteen H，Kamby C.Lack of effect from mitomycin c plus 5-fluorouracil in platin-resistant ovarian cancer a phase Ⅱ study［J］.Int J Gynecol Cancer，1995，5(5):386－9.

［7］Adjadj E，Roy S，Zimmermann C，et al.Dosage and kinetics of MMC release of a collagen implant used as a delivery device in glaucoma surgery in the rabbit eye［J］.J Fr Ophtalmol，2006，29(9):1042－6.

［8］Sato M，Onishi H，Takahara J，et al.In vivodrug release and an-titumor characteristics of water-soluble conjugates of mitomycin C with glycol-chitosan and N-succinyl-chitosan［J］.Biol Pharm Bull，1996，19(9):1170－7.

［9］van Ruth S，Mathot R A，Sparidans R W，et al.Population pharmacokinetics and pharmacodynamics of mitomycin during intraoperative hyperthermic intraperitoneal chemotherapy［J］.Clin Pharmacokinet，2004，43(2):131－43.

［10］Cerretani D，Roviello F，Pieraccini M，et al.Pharmacokinetics of intraarterial mitomycin C in hypoxic hepatic infusion with embolization in the treatment of liver metastases［J］.Vascul Pharmacol，2002，39(1－2):1－6.

［11］Song J S，Kim J H，Yang M H，et al.Concentrations of mitomycin C in rabbit corneal tissue and aqueous humor after topical administration［J］.Cornea，2006，25(10 Suppl 1):S20－S3.

［12］Xu Y，Kolesar J M，Schaaf L J，et al.Phase I and pharmacokinetic study of mitomycin C and celecoxib as potential modulators of tumor resistance to irinotecan in patients with solid malignancies［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2009，63(6):1073－82.

［13］Gu Y，Wang G J，Sun J G，et al.A new method for plasma citrate determination by reversed-phase high-performance liquid chromatography after ultrafiltration extraction:an example for bioequivalence evaluation of a medicinal endogenous substance［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2008，30(7):513－20.

［14］劉子修，劉史佳，居文政，等.UPLC-MS法測定大鼠血漿中積雪草苷的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(4):543－6.

［14］Liu Z X，Liu S J，Ju W Z，et al.Pharmacokinetic study of a siaticoside in rat plasma by UPLC-MS［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):543－6.

［15］白永濤，文紅梅，周 華，等.UPLC法測定大鼠血漿中大豆苷元濃度及藥動(dòng)學(xué)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(11):1512－5.

［15］Bai Y T，Wen H M，Zhou H，et al.Determination of daidzein and its pharmacokinetics in rat plasma by UPLC［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(11):1512－5.

［16］湯 瑤，張雙慶，李 響，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定兔血漿中的絲裂霉素 C［J］.色譜，2012，30(2):154－9.

［16］Tang Y，Zhang S Q，Li X，et al.Determination of mitomycin C in rabbit plasma by ultra-high performance cipid chromatography-trndem mass spectrometry［J］.Chin J Chromatogr，2012，30(2):154－9.