陳寶婷，徐福平，林愛華，劉奕明

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510120)

芒果苷(mangiferin)是常用中藥知母的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、退熱、鎮(zhèn)痛和抗寄生蟲等活性［1－3］。為深入探討芒果苷的腸吸收特性及與 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的關(guān)系，本文采用大鼠腸外翻模型，研究不同腸段、不同中藥環(huán)境(知母水煎液、知母-黃柏水煎液)以及P-gp抑制劑對芒果苷腸吸收的影響，為闡明芒果苷的腸吸收動力學(xué)機(jī)制，理解藥對知母黃柏的作用基礎(chǔ)，指導(dǎo)臨床遣方用藥和提高臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 芒果苷對照品(純度98%，天津市河北區(qū)雙吉色譜儀經(jīng)營部);鹽酸維拉帕米注射液(verapamil，Ver，上海禾豐制藥有限公司，Lot:100501);環(huán) 孢 素 A(cycloporineA，CsA，Lot:040842HB);實(shí)驗(yàn)用黃柏(Lot:090705661)、知母(Lot:090705211)，均購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司;乙腈，HPLC級，F(xiàn)isher公司;磷酸為色譜純。Krebs-Ringer試劑(K 氏液:NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，glucose 1.4 g，加純水定容至1 000 ml)。

1.2 儀器 美國WATERS超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng);臺式高速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司);德國IKA MS1型渦旋混勻器;恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司);十萬分之一電子天平(Mettler Toledo，AB135-S 型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SD♂大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SCKX(粵)0073276。

2 方法

2.1 供試液配制 芒果苷供試液:精密稱取芒果苷對照品20 mg，加適量二甲基亞砜(DMSO)超聲振蕩溶解，移至1 L容量瓶中，加K氏液定容，配制成濃度為20 mg·L－1的芒果苷供試液(DMSO終濃度＜0.1%)。

知母、知母-黃柏供試液:稱取知母15 g置于2 L圓底燒瓶中，加純水浸泡30 min后加熱回流提取3 次，每次1 h，3 次加水量分別為 500、300、300 ml，過濾，合并3次濾液，UPLC法測定芒果苷濃度［4］，以K氏液稀釋得到芒果苷濃度為20 mg·L－1的知母供試液。稱取知母15 g、黃柏15 g，按上述操作配制芒果苷濃度為20 mg·L－1的知母－黃柏供試液。

含Ver或CsA的芒果苷供試液:精密稱取芒果苷對照品10 mg，以少量DMSO振蕩溶解，分別加入Ver或CsA，以K氏液配成質(zhì)量濃度為芒果苷20 mg·L－1，Ver或 CsA 100 mg·L－1的供試液。

2.2 芒果苷濃度測定方法 采用UPLC法測定芒果苷。色譜條件:WATERS ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm);流動相為0.1%磷酸-乙腈，梯度洗脫(乙腈:0 min為5%，5.5 min為18%);流速0.25 ml·min－1;檢測波長260 nm;柱溫 35℃;進(jìn)樣量 5 μl。

2.3 大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn) 采用翻轉(zhuǎn)腸囊法［5］。大鼠隨機(jī)分組，每組5只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。腹腔麻醉，腹主動脈取血后，分別取空腸、回腸各10 cm，結(jié)腸7 cm，放入K氏液中沖洗，至無內(nèi)容物流出，小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪，將腸管一端結(jié)扎于自制塑料套管，翻轉(zhuǎn)后結(jié)扎另一端，使之形成囊狀。向腸囊中注入2 ml空白K氏液，將其移入已有K氏液的玻璃槽中平衡10 min后換成供試液100 ml，實(shí)驗(yàn)過程中保持37℃恒溫，并向玻璃槽中通入0.95 O2/0.05 CO2，在給藥后30、50、70、90 min 從腸囊內(nèi)取樣200 μl，同時補(bǔ)足相同體積的空白K氏液。將樣品經(jīng)13 000 r·min－1離心5 min，微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液5 μl進(jìn)樣測定樣品中芒果苷含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

Q為藥物各時間的累積吸收量，Cn為n時間點(diǎn)的實(shí)際檢測濃度，Ci為樣品濃度。

2.4.2 轉(zhuǎn)運(yùn)速率及表觀滲透系數(shù) Q對t做相關(guān)回歸分析，得出斜率除吸收表面積，求得轉(zhuǎn)運(yùn)速率Vt。表觀滲透系數(shù)按Paap=△Q/△t·A·C0計算，式中△Q為藥物在△t時間內(nèi)透過的量(μg);A為藥物透過的表面積(本模型中為腸腔中膜面積);C0為腸囊外側(cè)的初始給藥濃度。

3 結(jié)果

3.1 UPLC測定方法 K氏液、知母、知母-黃柏中其他成分對芒果苷的測定無干擾，專屬性較好(色譜圖見Fig 1);芒果苷在0.2～96 mg·L－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=1.2×104X－2.2×103，r=0.9999;低、中、高(0.9，38.4，76.8 mg·L－1)3個質(zhì)量濃度的芒果苷K氏液樣品日內(nèi)精密度RSD分別為0.54%，0.47%，0.29%;日間精密度RSD分別為1.36%，2.92%，1.92%。

3.2 芒果苷在不同腸段的吸收情況 芒果苷在空腸、回腸、結(jié)腸均有不同程度的吸收，并且在同一腸段Q隨時間延長呈線性增加(Fig 2)?；啬c的吸收參數(shù)Q90(90 min累積吸收量)、Vt和Paap均高于空腸組(P＜0.05)，芒果苷在不同腸段吸收趨勢為回腸＞結(jié)腸＞空腸，結(jié)果見Tab 1。

3.3 P-gp抑制劑對芒果苷吸收的影響 在90 min內(nèi)，Ver對芒果苷吸收有促進(jìn)作用但不明顯，而CsA組芒果苷在回腸的吸收量明顯高于單體組(Fig 3)，Q90、Vt和Paap比單體組增大(P＜0.05)，提示芒果苷可能是P-gp底物，CsA明顯提高芒果苷在回腸的吸收，見 Tab 1。

Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s，n=5)

Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s，n=5)

*P＜0.05 vs jejunum;#P＜0.05 vs mangiferin group at ileum

Intestine Group Q90/μg Vt/μg·cm－2·min－1 Paap/×10 －4，cm·min －1 Jejunum mangiferin 2.9484 ±0.7518 0.0041 ±0.0015 2.0350 ±0.7706 Colon mangiferin 4.3720 ±2.8159 0.0068 ±0.0048 3.3825 ±2.3781 Ileum mangiferin 6.4824 ±3.3958* 0.0104 ±0.0058* 5.1788 ±2.8999*mangiferin+Ver 11.4448 ±5.8714 0.0171 ±0.0113 8.5363 ±5.6694 mangiferin+CsA 13.1990 ±4.0660# 0.0206 ±0.0080# 10.3113 ±4.0032#Zhimu 12.7180 ±5.8105# 0.0204 ±0.0097# 10.190 ±4.8758#Zhimu-Huangbai 5.1304 ±2.0214 0.0079 ±0.00343.9650 ±1.7129

3.4 知母、知母-黃柏中芒果苷的吸收 Fig 3顯示，90 min內(nèi)知母組芒果苷在回腸的吸收量明顯高于芒果苷單體組和知母－黃柏組(P＜0.05)，Q90、Vt和Paap(Tab 1)比單體組和知母－黃柏組均升高(P＜0.05)，而知母－黃柏組與單體組比較芒果苷吸收無差異。

Fig 1 UPLC chromatograms of mangiferin. A:Blank Krebs;B:Blank Krebs mixed with mangiferin;C:Sample from gut sacs.

4 討論

離體組織實(shí)驗(yàn)必須考慮腸囊可能因離體時間太長而失去活性。文獻(xiàn)資料［6－7］報道目前實(shí)驗(yàn)大部分在60～90min內(nèi)，時間過長不能保證腸囊的生理活性，會導(dǎo)致腸囊的通透性發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)曾以測定腸囊內(nèi)營養(yǎng)液的乳酸脫氫酶的活力來評價腸細(xì)胞活性，結(jié)果顯示大鼠離體腸段在90 min內(nèi)可以保持腸細(xì)胞正常活性。

Fig 2 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different intestinal segments(±s，n=5)

本實(shí)驗(yàn)中芒果苷在空腸、回腸、結(jié)腸均有吸收，各個腸段Paap均大于1×10－4cm·min－1?；啬c是芒果苷腸吸收的最佳部位，因此本實(shí)驗(yàn)選擇回腸進(jìn)一步研究P-gp抑制劑與知母、知母－黃柏對芒果苷吸收的影響。

Fig 3 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different test solutions at ileum(±s，n=5)

P-gp是由MDR1基因編碼的膜蛋白，具有將藥物從腸漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)到腸黏膜而排入腸腔的作用，從而導(dǎo)致藥物的吸收量減少［8］。在合用不同P-gp抑制劑后發(fā)現(xiàn)，CsA可以提高芒果苷在回腸K氏液中的濃度(P＜0.05)，而Ver作用不明顯，但也有一定的促進(jìn)作用。此結(jié)果提示芒果苷可能是P-gp的底物。

知母組中芒果苷的Q90、Vt和Paap高于芒果苷單體組和知母－黃柏組給藥(P＜0.05)，這提示在知母水煎液給藥組中，知母中其它成分明顯促進(jìn)了芒果苷的腸吸收;當(dāng)伍用黃柏后芒果苷的吸收減少。前期曾對知母黃柏配伍對芒果苷大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響［9］進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)知母中芒果苷的血藥濃度和AUC(122.4 mg·L－1·h)比單體組(AUC 為0.626 mg·L－1·h)升高，配伍(1 ∶1)黃柏后 AUC(94.36 mg·L－1·h)下降，但仍明顯高于單體組，同時達(dá)峰時間Tmax明顯延長，表明配伍黃柏在一定程度上延緩了知母中芒果苷的吸收程度和速度，這與知母伍用黃柏后清熱而不化燥、養(yǎng)陰而不助濕的功效相一致。本文知母中芒果苷吸收明顯高于單體，與前期研究結(jié)果一致。配伍黃柏由于吸收延遲，而翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)時間僅為90 min，因此可能導(dǎo)致知母－黃柏組與單體組的腸吸收差異未完全顯現(xiàn)。本研究也提示我們中藥活性成分處于不同的處方環(huán)境則具有不同的吸收過程，研究其體內(nèi)吸收應(yīng)考慮復(fù)方多成分間相互作用。

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