張阿麗，張 弓，彭 晉，王全勝，馬 歡，鐘亞華，周福祥，謝叢華

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院放化療科，武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心，湖北武漢 430071;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖北武漢 430022)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤的首要致死原因，2010年美國新報(bào)告卵巢癌患者21 880人，全年有13 850例卵巢癌患者死亡［1］。上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型(epithelial to mesenchymal transition，EMT)可使癌細(xì)胞獲得遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移中有重要的作用。因?yàn)閮?nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)及內(nèi)皮素受體(ETAR)在卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)［2］，而且在腫瘤細(xì)胞中，ET-1/ETAR 自分泌通路通過誘導(dǎo)其纖維樣和侵襲表型，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT。ROCK為Rho GTPases的下游效應(yīng)分子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝以及細(xì)胞黏附斑的形成，在EMT中起重要作用［3］。轉(zhuǎn)錄因子SLUG在卵巢癌細(xì)胞EMT中也起重要作用［4］。目前，ROCK與SLUG的關(guān)系，以及它們?cè)贓T-1誘導(dǎo)上皮卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用還未見報(bào)道。本研究以人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和CaOV3為研究對(duì)象，通過給予ET-1刺激或激活ROCK等，觀察該細(xì)胞侵襲能力及EMT表型相關(guān)基因的改變以及轉(zhuǎn)錄因子SLUG的變化，探討ROCK/SLUG通路在ET-1誘導(dǎo)上皮卵巢癌細(xì)胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與抗體 人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3，CaOV3購自武漢大學(xué)生物醫(yī)學(xué)保藏中心，培養(yǎng)在含1% 青－鏈霉素和10%FBS的RPMI 1640(美國Invitro-gen公司)中。兔抗纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)抗體，鼠抗β-actin抗體和兔抗ROCK抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗 E-cadherin抗體(美國 Zymed公司)。

1.2 細(xì)胞免疫熒光染色 培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640中的SK-OV-3和CaOV3(1×105/孔)生長在蓋玻片上24 h，無血清過夜后，用ET-1(美國MP Biomedicals公司)處理24 h，在－20℃用甲醇固定20 min，用5%正常羊血清封閉，β-tubulin抗體(美國Zymed公司，1∶100)4℃孵育過夜，PBS漂洗后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后，用Nikon E-clipse E600熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及β-tubulin微管蛋白的表達(dá)，細(xì)胞核用PI染色。

1.3 Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn) Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)用于確定細(xì)胞的體外穿過基質(zhì)膠Matrigel的能力，方法參見文獻(xiàn)［5］。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)①:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激10 h后固定并用Diff-quick染色(美國VWR Scientific公司)，每個(gè)孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)均數(shù)，每個(gè)孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)②:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時(shí)加入ROCK抑制劑Y27632(LY)，或單用ROCK顯性激活的突變體轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)無處理的細(xì)胞為對(duì)照組，24 h后固定并用Diff-quick染色(美國VWR Scientific公司)，每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞均數(shù)，每個(gè)孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 蛋白的提取和Western blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)①:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激24 h收集樣本，以未刺激的細(xì)胞為對(duì)照組。用RIPA裂解液(美國Pierce公司)提取細(xì)胞蛋白，參照我們前期的方法［6］，Western blot檢測(cè)E-cadherin和纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的表達(dá);實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)②:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時(shí)加入ROCK抑制劑Y27632(LY)，或單用ROCK顯性激活的突變體轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)無處理的細(xì)胞為對(duì)照組。用RIPA裂解液(美國Pierce公司)提取細(xì)胞蛋白，參照我們前期的方法［6］，Western blot檢測(cè)ROCK和FN的表達(dá)。

1.5 總RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)方案①:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1 刺激，分別在 0，3，6，12，24 h收集細(xì)胞，檢測(cè)SLUG、Snail和Twist轉(zhuǎn)錄水平;實(shí)驗(yàn)方案②:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時(shí)加入或不加 1 μmol·L－1ET-1 受體拮抗劑(endothelin A receptor，ETAR)(美國 Calbiochem 公司)，24 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)SLUG轉(zhuǎn)錄水平;實(shí)驗(yàn)方案③:SK-OV-3和CaOV3種植在6孔板中無血清過夜后，轉(zhuǎn)染ROCK的顯性激活突變體后，分別在0，24，48，72 h收集細(xì)胞，檢測(cè)SLUG和E-cadherin的轉(zhuǎn)錄水平。

用TRIzol試劑(美國Gibco公司)提取細(xì)胞的總RNA?？俁NA用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄，并在第1鏈CDNA中加入寡核苷酸引物。應(yīng)用SYBR-Green的方法進(jìn)行real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參照。PCR條件:95℃ 1 min，55℃ 1 min，and 72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。引物序列如下:GAPDH:sense 5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3'Antisense5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3';SLUG:sense5'-TGATGAAGAGGAAAGACTACAG-3'antisense5'-GCTCACATATTCCTTGTCACAG-3';Snail:sense 5'-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3'antisense 5'-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3';TWIST:sense 5'-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3'Antisense 5'-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3';ROCK:sense 5'-GATGGATTGGATGCTTTGGTTTA-3'Antisense5'-GCTGAACAACCCAAGGACTA-3';E-cadherin:sense 5'-AGAATGACAACAAGCCCGAAT-3'antisense 5'-CGGCATTGTAGGTGTTCACA-3'。

1.6 報(bào)告基因分析 SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1.5 μg含SLUG啟動(dòng)子的pGL3 basic質(zhì)粒與15 ng Renilla質(zhì)粒(promega)。它們共轉(zhuǎn)染 ROCK的顯性激活突變體［7］(由美國賓西法尼亞大學(xué)生物工程系Chen CS教授惠贈(zèng))或者與ROCK抑制劑Y27632共同孵育。24 h后，使用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒 (美國Promega公司)檢測(cè)熒光素酶與Renilla的熒光值，用Luciferase熒光值/Renilla熒光值代表熒光素酶的活性。結(jié)果以±s表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 ET-1誘導(dǎo)SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞形態(tài)，βtubulin微管蛋白，以及EMT標(biāo)志蛋白的變化 用100 nmol·L－1ET-1孵育 SK-OV-3和 CaOV3細(xì)胞24 h，共聚焦顯微鏡觀察胞質(zhì)中β-tubulin微管蛋白的變化。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的形態(tài)而變得有較長，較多的偽足，胞質(zhì)中β-tubulin微管蛋白(免疫熒光染色為綠色)被拉長，呈現(xiàn)為纖維細(xì)胞的表型(Fig 1A)。Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明暴露給ET-1增加了細(xì)胞的體外侵襲力(Fig 1B);給予100 nmol·L－1ET-1刺激SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)ET-1處理后Fibronectin表達(dá)量增加，是對(duì)照組的3倍多;而E-cadherin的表達(dá)降低。這些結(jié)果表明ET-1刺激影響了SK-OV-3和CaOV3 EMT基因的表達(dá)變化以及EMT相關(guān)形態(tài)的改變(Fig 1C)。

2.2 ET-1促進(jìn)SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SLUG的轉(zhuǎn)錄 在ET-1誘導(dǎo)SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞EMT的同時(shí)，我們用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子如SLUG、Twist及Snail的表達(dá)變化。如Fig 2A和B，ET-1刺激24 h后，SLUG mRNA表達(dá)水平增加，但是Snail mRNA的水平?jīng)]有變化，而Twist mRNA水平下降。為了進(jìn)一步證實(shí)ET-1對(duì)SLUG mRNA的表達(dá)影響，我們分析了給予100 nmol·L－1ET-1 處理細(xì)胞 3、6、12、24 h 不同時(shí)間點(diǎn)情況下，SLUG mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ET-1作用3 h后SLUG mRNA水平即開始增加，在24 h時(shí)達(dá)到了最高點(diǎn)。而且，ET-1誘導(dǎo)SLUG mRNA的增加可以完全被ETAR拮抗劑BQ123所阻斷(Fig 2C和D)。這些結(jié)果表明在E-cadherin 3個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子中，SLUG是唯一一個(gè)能被 ET-1/ETAR刺激信號(hào)上調(diào)的因子。

Fig 1 ET-1 induced morphologic and related gene changes of EMT in CaOV3 and SK-OV-3 cells

2.3 ET-1活化 ROCK 促進(jìn) SK-OV-3和 CaOV3細(xì)胞EMT 為探討ET-1是否通過活化ROCK促進(jìn)SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞EMT，我們用ET-1或ET-1聯(lián)合ROCK抑制劑Y27632或聯(lián)合使用ROCK的顯性激活突變體處理SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞后檢測(cè)ROCK和間充質(zhì)標(biāo)記基因Fibronectin蛋白表達(dá)。如Fig 3A和B所示，在未處理組細(xì)胞，ROCK和Fibronectin的蛋白表達(dá)水平較低，當(dāng)ET-1處理后，ROCK和Fibronectin蛋白表達(dá)水平迅速升高;ROCK抑制劑Y27632能抑制ET-1對(duì)ROCK和Fibronectin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。而當(dāng)ET-1與ROCK顯性激活突變體聯(lián)合使用時(shí)，ROCK和Fibronectin蛋白表達(dá)明顯增加;如Fig 3C所示，Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明:ET-1處理SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞后，其侵襲力明顯增加，而ROCK的抑制劑Y27632能抑制其增加，轉(zhuǎn)染ROCK顯性激活突變體能促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的侵襲力增加。這些結(jié)果表明，ET-1通過活化ROCK誘導(dǎo)SK-OV-3和CaOV3細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲力。

Fig 2 ET-1 increases the level of SLUG mRNA in SK-OV-3 and CaOV3 cells

2.4 ROCK上調(diào) SK-OV-3和 CaOV3細(xì)胞中SLUG的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性，促進(jìn)SLUG轉(zhuǎn)錄，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄 由于ROCK與上皮性腫瘤細(xì)胞的侵襲相關(guān)，我們假設(shè)ROCK可能在轉(zhuǎn)錄水平激活SLUG并抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志基因E-cadherin轉(zhuǎn)錄。如Fig 4A和B，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果提示，ROCK顯性激活突變體轉(zhuǎn)染后24 h，SLUG mRNA水平增加，在轉(zhuǎn)染后48 h達(dá)到最高，同時(shí)E-cadherin mRNA減少;為確定SLUG是否為ROCK的下游靶基因，我們克隆SLUG啟動(dòng)子序列到熒光素酶(luciferase)基因的上游。熒光素酶分析提示，ROCK激活引起SLUG啟動(dòng)子活性增加2.5倍，ROCK抑制劑Y27632的明顯減少了SLUG啟動(dòng)子活性(Fig 4C)。該結(jié)果表明，ROCK通過上調(diào)SLUG啟動(dòng)子活性增加了SLUG的轉(zhuǎn)錄水平。

Fig 3 ET-1 induced EMT of CaOV3 and SK-OV-3 cells by active ROCK(±s，n=3)

3 討論

約80%的卵巢癌為上皮來源的，上皮性卵巢癌被認(rèn)為是由正常卵巢上皮轉(zhuǎn)型而來，具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)上皮性腫瘤獲得侵襲表型即向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，此病理過程稱為EMT。EMT促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲，是與腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要細(xì)胞過程。

Fig 4 ROCK increases SLUG mRNA synthesis by up-regulation of SLUG promoter activity，and then inhibits E-cadherin mRNA in CaOV3 and SK-OV-3 cells(±s，n=3)

基于以下證據(jù)，本研究首次報(bào)道 ET-1活化ROCK/SLUG通路，誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。①ET-1與細(xì)胞ETAR結(jié)合，改變了許多關(guān)鍵基因的表達(dá)，包括下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞的侵襲力。②ET-1誘導(dǎo)了E-cadherin的主要抑制基因SLUG的轉(zhuǎn)錄和SLUG蛋白的表達(dá);而且，ETAR拮抗劑BQ123消除了ET-1對(duì)SLUG的誘導(dǎo)作用。③ ET-1通過活化ROCK信號(hào)誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞EMT發(fā)生。因?yàn)檗D(zhuǎn)染ROCK顯性激活突變體可與ET-1共同誘導(dǎo)EMT，反之，ROCK抑制劑Y27632，阻斷了ET-1對(duì)EMT的誘導(dǎo)作用。④ROCK通過上調(diào)SLUG基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性促進(jìn)SLUG基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。這些表明在ET-1誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中，SLUG是ROCK下游靶基因，ROCK/SLUG通路在ET-1誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT中起重要作用。因?yàn)樯掀ば阅[瘤進(jìn)展的兩個(gè)基本特征是喪失正常上皮的結(jié)構(gòu)以及和微環(huán)境的相互作用［3］，所以本研究闡明了ET-1是通過活化ROCK/SLUG信號(hào)通路，從而促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT以及惡性進(jìn)展與轉(zhuǎn)移。

E-cadherin的功能缺失被認(rèn)為是EMT的關(guān)鍵步驟。E-cadherin的缺失也導(dǎo)致上皮級(jí)性的完全喪失。E-cadherin的缺失可因基因突變，染色體缺失，蛋白酶的剪切或者上皮cadherin基因(epithelial cadherin gene，CDH1)啟動(dòng)子的沉默而引起［8］。CDH1啟動(dòng)子的沉默可因DNA高度的甲基化而引起或者轉(zhuǎn)錄因子如SLUG，Snail Twist與CDH1啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合而抑制 CDH1啟動(dòng)子的活性［9－11］。SLUG、Snail為鋅指結(jié)合蛋白，屬于 Snail超家族成員［12］。在上皮細(xì)胞中外源性表達(dá)SLUG，Snail會(huì)引起EMT，表現(xiàn)為遷移和侵襲特征，此現(xiàn)象在卵巢癌中也觀察到［4］。本研究表明，ET-1誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，伴有SLUG mRNA的上調(diào)，但是Snail mRNA的表達(dá)沒有變化。雖然兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子來自于相同的家族，但是可能會(huì)在不同的腫瘤環(huán)境和特殊的細(xì)胞類型中發(fā)揮不同的作用［9］。

Rho/ROCK信號(hào)通路涉及到多種癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲［13－14］，包括人卵巢癌細(xì)胞［15－16］。SLUG 可以抑制上皮細(xì)胞表型基因 Cadherin的表達(dá)［17］，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞表型基因如 Fibronectin的表達(dá)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，ET-1誘導(dǎo) SLUG蛋白的表達(dá)可由ROCK抑制劑Y27632所逆轉(zhuǎn)，相反，ROCK的顯性激活突變體可與ET-1協(xié)同增加SLUG的表達(dá)，而且ROCK活化能上調(diào)SLUG基因的轉(zhuǎn)錄;本研究也觀察到ROCK抑制劑Y27632或ROCK的顯性激活突變體可以調(diào)節(jié)人卵巢癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白如E-cadherin、Fibronectin的表達(dá)。

總之，本研究顯示，ET-1通過活化ROCK/SLUG信號(hào)通路，從而促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，這表明抑制ROCK/SLUG活化，有可能逆轉(zhuǎn)人卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

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