劉莎莎，高維娟，錢 濤，張 霞

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050026)

缺血性腦血管疾病是臨床常見且嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，其中腦缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是缺血性腦血管病發(fā)病的重要病理生理過(guò)程。在缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元損傷的發(fā)生機(jī)制之一，其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)信號(hào)通路在腦缺血/再灌注損傷過(guò)程中尤其是程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［1］。黃芪注射液(astragalus injection)為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［2］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃芪注射液可抑制全腦缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，并且對(duì)離體培養(yǎng)的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有抑制作用［3］，但黃芪注射液是否通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路上的關(guān)鍵激酶JNK3而起作用，尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)建立全腦缺血/再灌注大鼠模型觀察黃芪注射液對(duì)腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白及其mRNA表達(dá)的影響，探討黃芪注射液抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康♂ SD大鼠258只，體重(220～280)g，由天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(津)2009-0001。

1.2 試劑和儀器 兔抗大鼠JNK3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司;兔抗大鼠JNK3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;小鼠抗大鼠β-actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司;JNK3引物由上海基康生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RTPCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，20 ml/支(每1 ml相當(dāng)于 2 g生藥)，生產(chǎn)批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021776;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。TDL-40B離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器制造廠產(chǎn)品;DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡:日本OLYMPUS公司生產(chǎn);石蠟切片機(jī):德國(guó)LEICA公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、模型組、黃芪注射液組和黃芪注射液溶劑對(duì)照組，各組根據(jù)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)再分為0、0.5、2、6、24、72 h 和120 h 7 個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只動(dòng)物。

1.4 模型制備 采用改良的Pulsinelli’s 4VO(four vessel occlusion，4vo)法制備腦缺血/再灌注動(dòng)物模型:大鼠于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于固定臺(tái)上，在枕骨后切開皮膚，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞，縫合切口。24 h后將大鼠乙醚麻醉，仰臥固定，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以“4”號(hào)絲線穿線備用，待大鼠清醒后用微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成腦缺血，30 min后松開微動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，縫合切口。模型成功標(biāo)準(zhǔn)為:雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后1 min內(nèi)動(dòng)物意識(shí)喪失;眼球變白，雙側(cè)瞳孔散大，對(duì)光反射消失;翻正反射消失。凡不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者或再灌注期間出現(xiàn)全身強(qiáng)直、抽搐等異常反應(yīng)或死亡者都被視作不成功。假手術(shù)組只做皮膚切口和組織分離。黃芪注射液組缺血前30 min腹腔注射黃芪注射液［12 g(生藥)·kg－1］，其中 24、72、120 h 組手術(shù)后每隔24 h追加給藥1次，以確保穩(wěn)定的血藥濃度。黃芪注射液溶劑對(duì)照組腹腔注射與黃芪注射液等量的無(wú)菌去離子水。

1.5 標(biāo)本制備 于再灌注后的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)從每組大鼠中隨機(jī)選取6只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續(xù)切片;其余各組大鼠4%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速斷頭處死，在低溫修塊臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織，置于Eppendorf管中，－80℃保存，備用。

1.6 HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變

腦缺血/再灌注后120 h從各組大鼠中取6只大鼠的海馬組織切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變。

1.7 免疫組化法檢測(cè)海馬組織JNK3的表達(dá) 從每組大鼠中取6只大鼠的海馬組織切片，采用SP法檢測(cè)JNK3的表達(dá)，具體操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。兔抗大鼠JNK3多克隆抗體按1∶75稀釋;PBS代替一抗作陰性對(duì)照。選用Med6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)物灰度值:在切片的海馬CA1區(qū)各選取3個(gè)測(cè)量點(diǎn)，首先測(cè)定各點(diǎn)的顆粒細(xì)胞層灰度值，再用該測(cè)量值減去相應(yīng)的背底灰度值后求平均值，即為大鼠海馬CA1區(qū)JNK3表達(dá)的免疫反應(yīng)灰度值。

1.8 Western blot法檢測(cè)海馬組織JNK3蛋白表達(dá) 從每組取6只大鼠的海馬組織(－80℃保存)，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取25 μg樣品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉過(guò)夜，兔抗大鼠JNK3單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育2 h。山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，4℃搖床孵育1 h。洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行定量分析。

1.9 RT-PCR法檢測(cè)海馬組織JNK3 mRNA的表達(dá) 從每組取6只大鼠的海馬組織(－80℃保存)，用TRIzol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照GAPDH引物序列上游 5'-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3'，下游5'-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為134 bp，JNK3引物序列上游5'-CGGATTCCGAGCACAATAAAC-3'，下 游 5'-AGGGTCGTACCAAACGTTGATGT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s;56℃ 30 s;72℃ 40 s，循環(huán)30次;最后于72℃延伸3 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。用凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變HE染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組組織形態(tài)無(wú)異常改變，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;而模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯的病理改變，鏡下可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，界限不清楚，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，固縮成三角形或不規(guī)則型;與模型組相比，黃芪注射液組病理變化得到一定程度的改善，海馬神經(jīng)元排列較整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組則無(wú)明顯改變，見Fig 1。

Fig 1 Pathological changes in hippocampus CA1 zone of rats 120 h after cerebral ischemia reperfusion in different groups(×400)

Fig 2 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(×400)

2.2 免疫組化法檢測(cè)海馬組織JNK3蛋白表達(dá)免疫組化染色結(jié)果:陽(yáng)性反應(yīng)為胞質(zhì)黃染，胞核內(nèi)有少許棕黃色顆粒。與假手術(shù)組比，模型組于再灌注0、0.5、2、6、24 h 和72 h JNK3 的表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，120 h組與假手術(shù)組比差異無(wú)顯著性(P＞0.05);與模型組比，除120 h外，黃芪注射液組各時(shí)間點(diǎn)JNK3的表達(dá)均降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)，見Fig 2、Fig 3。

2.3 黃芪注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:除120 h外，與假手術(shù)組比模型組各時(shí)間點(diǎn)JNK3蛋白表達(dá)平均灰度值均增高(P＜0.05);與模型組比，黃芪注射液組除120 h外的各時(shí)間點(diǎn)JNK3蛋白表達(dá)灰度值均降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組則無(wú)差異(P＞0.05)，見Fig 4、5。

Fig 3 Effect of astragalus injection on surface density value of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

Fig 4 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats

Fig 5 Effect of astragalus injection on mean optic density of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

2.4 黃芪注射液對(duì)腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示:JNK3 mRNA表達(dá)同JNK3蛋白表達(dá)趨勢(shì)相一致，見Fig 6、7。

3 討論

腦缺血后恢復(fù)腦血流是治療腦缺血最關(guān)鍵的方法，但再灌注后可加重缺血腦組織的損傷，而這種損傷以細(xì)胞凋亡為主。王鳳章等報(bào)道［4－5］，細(xì)胞凋亡是顳葉CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞缺血/再灌注后的主要死亡形式。細(xì)胞凋亡的發(fā)生需要一個(gè)把細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的傳遞者，而JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［6］。

Fig 6 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 mRNA in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats

c-jun氨基末端激酶(JNKs)家族是MAPKs家族成員之一，屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在脊椎動(dòng)物，有3種編碼JNK的基因jnk-1、jnk-2和 jnk-3［7］，其相應(yīng)的編碼產(chǎn)物 JNK1和 JNK2在各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而JNK3則主要表達(dá)于腦組織［8］。在鈣離子超載、氧自由基等應(yīng)激刺激下，位于胞質(zhì)中的JNK3被激活后迅速轉(zhuǎn)位入胞核，調(diào)節(jié)c-jun等凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。JNK可調(diào)控ATF2內(nèi)在的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性和泛素介導(dǎo)的AP-1蛋白降解，提高轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性［9］，從而引發(fā)JNK下游底物caspase等的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

Fig 7 Effect of astragalus injection on mean optic density of JNK3 mRNA in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

黃芪是中醫(yī)治療腦血管病的常用藥物，藥理學(xué)研究表明黃芪能明顯提高腦缺血/再灌注大鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)和一氧化氮(NO)含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注等，從而有效對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷［10］。黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、通脈養(yǎng)心、健脾利濕等功效。賴真等［11］研究表明黃芪注射液能減少大鼠腦缺血/再灌注后的神經(jīng)元凋亡。

本實(shí)驗(yàn)采用4VO法建立腦缺血/再灌注大鼠模型，HE染色觀察海馬組織病理學(xué)改變，并分別從蛋白和基因水平觀察黃芪注射液對(duì)腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:腦缺血/再灌注后120 h模型組出現(xiàn)明顯的病理改變，表明4VO法可成功模擬腦缺血/再灌注損傷。免疫組化結(jié)果顯示:假手術(shù)組可見JNK3輕度表達(dá)，且主要位于胞質(zhì)，而模型組可在胞質(zhì)及胞核內(nèi)同時(shí)發(fā)現(xiàn)JNK3陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)，提示腦缺血/再灌注后，激活的JNK3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而通過(guò)激活一系列下游轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。黃芪注射液可明顯降低腦缺血再灌注后 0、0.5、2、6、24 h和 72 h各時(shí)間點(diǎn)JNK3蛋白及mRNA的表達(dá)，表明黃芪注射液可抑制腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達(dá)，從而減少JNK3蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡，這可能是其對(duì)腦缺血/再灌注損傷起保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注120 h組JNK3的表達(dá)與假手術(shù)組比差異無(wú)顯著性，說(shuō)明黃芪注射液在腦損傷的早期用藥療效較好。

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