耿衛(wèi)樸，徐 曼，羅 祎，王婷婷，黃文煉，陳 瑜

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.病理教研室，分子與腫瘤研究中心，2.附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

手術(shù)、放療和化療是目前臨床治療惡性腫瘤的常規(guī)治療方法，但放療和化療都有明顯的毒副作用。靈芝和當(dāng)歸因無明顯毒副作用，有一定的“生血”和增強(qiáng)患者機(jī)體抵抗力效果，故常用于腫瘤患者的輔助治療［1］，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。

靈芝多糖是靈芝(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)的水提取物中主要的活性成分，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明它對(duì)抗原遞呈細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)以及體液免疫和細(xì)胞免疫均有調(diào)節(jié)作用，尤其通過促進(jìn)T細(xì)胞功能而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)小鼠機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)［2-4］;文獻(xiàn)報(bào)道靈芝多糖促進(jìn) ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖，還促進(jìn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，尤其是Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12的表達(dá)。此外，靈芝多糖還有助于 γ射線損傷T細(xì)胞的修復(fù)［5］。當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是當(dāng)歸水溶性提取物。文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)歸提取物能促進(jìn)PI3K/ALT信號(hào)通路，該作用可能參與抑制小鼠外周血細(xì)胞的凋亡;此外，它還促進(jìn)小鼠脾臟T細(xì)胞增殖、抑制移植性腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間［6-7］。因PI3K/Akt信號(hào)途徑在T細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的效應(yīng)分子，本研究采用免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、MTT和ELISA方法觀察了靈芝多糖和當(dāng)歸多糖對(duì)人外周血活化T細(xì)胞PI3K和Caspase-3蛋白表達(dá)及T細(xì)胞增殖、凋亡和分泌細(xì)胞因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新鮮人外周血取自健康獻(xiàn)血者;人淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品;尼龍毛為德國(guó)KISKER公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清和胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;靈芝多糖和當(dāng)歸多糖為陜西慈緣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PHA和MTT為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;細(xì)胞增殖試劑盒為南京凱基生物公司產(chǎn)品;IFN-γ試劑盒為美國(guó)RD公司產(chǎn)品;鼠抗人PI3K和Caspase-3抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備集團(tuán)公司，蘇州)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SHEL-LAB公司，美國(guó))，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter XL公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 健康人外周血T細(xì)胞的分離活化和培養(yǎng)新鮮抗凝外周血梯度離心后吸取單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)尼龍毛柱獲得T淋巴細(xì)胞。將T淋巴細(xì)胞分為對(duì)照組、靈芝多糖組和當(dāng)歸多糖組，在含PHA(10 mg·L-1)的RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，各組分別加入PBS、靈芝多糖(100 mg·L-1)和當(dāng)歸多糖(100 mg·L-1)培養(yǎng)1、2、24、72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。

1.2.2 免疫熒光觀察各組T細(xì)胞PI3K和Caspase-3蛋白表達(dá) T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)1、2和24 h后細(xì)胞涂片及10%甲醛固定后，分別加入鼠抗人PI3K抗體(1∶50)和Caspase-3抗體(1∶50)4℃冰箱孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗鼠抗體(1∶50)37℃避光孵育1 h后，PBS清洗并用甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 MTT檢測(cè)T細(xì)胞增殖 將對(duì)照組、靈芝多糖組和當(dāng)歸多糖組T細(xì)胞分別培養(yǎng)72 h并接種于96 孔板(每孔100 μl，細(xì)胞數(shù)1×108·L-1)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入MTT溶液10 μl(5 g·L-1)培養(yǎng)4 h后，離心后吸去上清并加入二甲基亞砜(60 μl/孔)，低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率 收集上述各組培養(yǎng)72 h的T淋巴細(xì)胞，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇固定24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率。

1.2.5 ELISA檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量 分別收集對(duì)照組、靈芝多糖組和當(dāng)歸多糖組T細(xì)胞培養(yǎng)72 h的上清液，按ELISA試劑盒說明書操作檢測(cè)各組T淋巴細(xì)胞的IFN-γ含量。

1.2.6 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用圖像分析系統(tǒng)(Imagepro-Plus)對(duì)免疫熒光染色陽(yáng)性強(qiáng)度進(jìn)行分析。隨機(jī)選5個(gè)高倍視野測(cè)量PI3K和Caspase-3的平均光密度，計(jì)算出平均值。采用SPSS 17.0軟件計(jì)算各組數(shù)據(jù)的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 靈芝多糖和當(dāng)歸多糖對(duì)T細(xì)胞PI3K表達(dá)和T細(xì)胞增殖的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示空白對(duì)照組、靈芝多糖組及當(dāng)歸多糖組T細(xì)胞培養(yǎng)1、2及24 h后細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)PI3K蛋白，但各組間平均光密度值無明顯差別。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組、靈芝多糖組及當(dāng)歸多糖組T細(xì)胞增殖的OD值如表1，靈芝多糖組、當(dāng)歸多糖組與空白對(duì)照組間差異均有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。

2.2 靈芝多糖和當(dāng)歸多糖對(duì)T細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響 正常人外周血T細(xì)胞與靈芝多糖和當(dāng)歸多糖混合培養(yǎng)72 h后，各組細(xì)胞的G1、G2/M期及S期分布無差別。

2.3 靈芝多糖和當(dāng)歸多糖對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)及凋亡的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示空白對(duì)照組和當(dāng)歸多糖組培養(yǎng)24 h后T細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的平均光密度值分別為0.51±0.24和0.46±0.22，兩組間差別無顯著性;而靈芝多糖組T細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的平均光密度值為0.38±0.16，明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)(Fig 1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照組和當(dāng)歸多糖組T細(xì)胞凋亡率分別為29.74%和29.87%，兩組間差別無顯著性;而靈芝多糖組T細(xì)胞凋亡率為18.23%，明顯低于前兩組。

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

t=16.955，＊＊P=0.003＜0.01 vs blank control;t=6.634，*P=0.022＜0.05 vs blank control

Group Blank control GLP ASP OD value 0.36±0.04 0.55±0.02＊＊ 0.52±0.02*

Fig 1 The expression of Caspase-3 of T lymphocytes

2.4 靈芝多糖和當(dāng)歸多糖對(duì)T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示T細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，空白對(duì)照組上清液中IFN-γ含量為(1850.09±93.34)ng·L-1，靈芝多糖組和當(dāng)歸多糖組上清液中IFN-γ含量分別為(2071.41±166.40)ng·L-1和(2030.33±28.76)ng·L-1，均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 IFN-γ concentration in supernatant of T lymphocytes

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到靈芝多糖和當(dāng)歸多糖均促進(jìn)人外周血T細(xì)胞PI3K的表達(dá)，使T細(xì)胞增殖水平明顯提高。PI3K在T細(xì)胞生存和增殖中的重要作用已得到研究者的證實(shí)，如 Hand等［8］發(fā)現(xiàn)無論記憶CD8+T還是效應(yīng)CD8+T細(xì)胞都依賴于PI3K而生存，Soond等［9］發(fā)現(xiàn)PI3K不僅參與初始T細(xì)胞的分化，還與其分泌IFN-γ有密切關(guān)系。但本實(shí)驗(yàn)觀察到空白對(duì)照組的T細(xì)胞也表達(dá)蛋白激酶PI3K，這可能與該組T細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入了具有刺激細(xì)胞增殖作用的PHA有關(guān)。Li等［10］還報(bào)道靈芝多糖可通過激活PKC和PKA激酶誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞免疫，提示PI3K可能只是靈芝多糖刺激T細(xì)胞增殖的信號(hào)途徑之一。Liu等［11］報(bào)道當(dāng)歸多糖也通過PI3K途徑促進(jìn)小鼠造血干細(xì)胞增殖。當(dāng)歸多糖還能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，并刺激免疫功能低下小鼠的CD4+T細(xì)胞增生。我們對(duì)照觀察靈芝多糖、當(dāng)歸多糖與對(duì)照組T細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，結(jié)果3組間并無明顯差別，這可能與空白對(duì)照組培養(yǎng)液內(nèi)的PHA作為有絲分裂原也促進(jìn)T細(xì)胞的細(xì)胞周期運(yùn)行，但靈芝多糖和當(dāng)歸多糖促進(jìn)了更多的T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到靈芝多糖和當(dāng)歸多糖均能降低人外周血活化T細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)，尤其是靈芝多糖下調(diào)Caspase-3表達(dá)和抑制T細(xì)胞凋亡的作用明顯。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤患者外周血T細(xì)胞Caspase-3高表達(dá)與 T細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［12］。Liu等［11］報(bào)道當(dāng)歸多糖具有抑制小鼠造血干細(xì)胞凋亡的作用，但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)其有抑制人外周血T細(xì)胞凋亡的作用，推測(cè)當(dāng)歸多糖抗凋亡的作用可能在人和鼠之間存在差異。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到靈芝多糖和當(dāng)歸多糖均明顯促進(jìn)人外周血T細(xì)胞分泌IFN-γ。Gao等［13］證實(shí)靈芝多糖喂飼荷瘤小鼠明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)靈芝多糖不僅刺激了小鼠脾細(xì)胞的增殖，還促進(jìn)了IFN-γ的分泌，T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用也明顯增強(qiáng)。靈芝多糖促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖及分泌IFN-γ與細(xì)胞內(nèi)GTP酶、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白等的活化，抑制凋亡相關(guān)蛋白如 CARD、β-actin，tubulin-α2，copine I和 γ-actin等活化有關(guān)［14］。我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中靈芝多糖和當(dāng)歸多糖促進(jìn)外周血T細(xì)胞分泌IFN-γ的作用可能與它們通過PI3K途徑促進(jìn)T細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3從而抑制T細(xì)胞凋亡的作用密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明當(dāng)歸多糖和靈芝多糖具有促進(jìn)人T細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ的功能，靈芝多糖還具有抑制T細(xì)胞凋亡的作用。因此，靈芝多糖和當(dāng)歸多糖具有確切的促進(jìn)人外周血T細(xì)胞免疫的作用。

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