何國榮，成銀霞，穆 鑫，李曉秀，于 昕，王月華，方蓮花，杜冠華

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，“藥物靶點研究與新藥篩選”北京市重點實驗室，北京 100050;2.煙臺大學藥學院藥理學教研室，山東煙臺 264005)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中腦黑質進行性退變而引起的神經退行性疾病，PD的發(fā)生與年齡老化、環(huán)境毒素以及遺傳易感性等因素有關。藥物治療是目前治療PD的主要方法，較為有效的是以左旋多巴為代表的多巴胺(dopamine，DA)替代療法，然而，長期應用左旋多巴會出現(xiàn)運動波動和運動障礙等副作用，使用后期還會加速PD自然病程。針對其他靶點的藥物也存在療效不理想、副作用大等缺陷［1］。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為抗PD藥物研究的熱點。

木犀草素(luteolin)廣泛分布在金銀花、菊花、青蘭、紫蘇、白毛夏枯草等植物中，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用，臨床用于治療腫瘤，肝炎，肌萎縮性脊髓側索硬化癥等。近期研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制神經元氧化應激損傷，具有神經保護作用［2－4］。蘆丁(rutin)又名蕓香苷，是主要存在于蕓香全草、豆科植物槐的花蕾、果實、金絲桃科植物紅旱蓮全草及蓼科植物蕎麥籽苗中的一種黃酮類化合物。研究表明蘆丁具有止血、降壓、抗炎、抗病毒、舒張血管、抑制腦梗死等多方面的生物學活性，其復方制劑對心腦血管疾病有明顯的治療作用，特別是血管性癡呆［5－6］。這些研究結果提示，木犀草素和蘆丁均對神經退行性疾病可能有較好的療效。

本實驗室前期建立了6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷 SH-SY5Y細胞模型和促PC12細胞分化模型，對天然產物庫內樣品進行活性篩選，發(fā)現(xiàn)木犀草素和蘆丁組合物(mixture of luteolin and rutin，MLR)能劑量依賴性地減輕6-OHDA誘導的細胞損傷和促PC12細胞分化。本研究采用腦室內注射6-OHDA制備PD大鼠模型，進一步考察MLR對模型大鼠的行為及中腦神經元損傷的改善作用，并從抑制炎癥、保護神經元及恢復神經元功能等方面探討MLR可能的作用機制，為其應用于PD臨床治療提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Sprague Dawley(SD)大鼠，2～3月齡，♂，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2007-0001。動物飼養(yǎng)條件為:溫度(22±1)℃，相對濕度:55%-65%，通風干燥，12 h光照周期。

1.1.2 儀器 MP8001腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，DXP-2大小鼠轉棒儀和DZIL-2大鼠自主活動程序自動控制儀(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)，BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，5810R型高速低溫離心機(美國Eppendorf公司)，SM900冰凍切片機(美國Leica公司)，X71正置熒光顯微鏡(日本OLYPUS公司)。

1.1.3 試劑與藥品 MLR(美國 SYNORx，Inc.生產，批號:062107，含木犀草素和蘆丁各50%)。美多芭片(上海羅氏制藥有限公司生產，批號:SH 0502)。6-OHDA、DA、阿 樸 嗎 啡 (apomorphine，APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(trysine hydroxylase，TH)抗體，購自Sigma-aldrich公司;多巴胺轉運體(dopamine transport protein，DAT)抗體、膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)、購自Santa Cruz公司，羊抗小鼠IgG、卵白素-生物素過氧化物酶復合物(Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC)試劑盒、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色劑，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 健康♂ SD大鼠，3%的戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，在左側相當于前腦內側束(medial forebrain bundle，MFB)區(qū)的顱骨表面鉆孔，直徑約2.5 mm。清理腦膜后，行MFB兩點注射6-OHDA(4 g·L－1)，(1)TB:－2.3 mm，AP:－4.4 mm，ML:1.2 mm，V:－7.8 mm;(2)TB:+3.4 mm，AP:－4.0 mm，ML:0.8 mm，V:－8.0 mm。在三維推動器的引導下兩點各注射 6-OHDA 3 μl，注射速度 1 μl·min－1，注射完畢后留針10 min，緩慢退針。術后連續(xù)3 d肌注青霉素20萬U·d－1以防感染。大鼠清醒后置于籠內正常環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2 模型評價 術后1周大鼠給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)，于直徑40 cm的有機玻璃桶中觀察其運動變化，每周1次，連續(xù)測試2周，若大鼠恒定向右旋轉，且旋轉圈數＞280 r/40 min，則視為造模成功，經過上述方法篩選，獲得58只合格模型動物。

1.2.3 分組與給藥 將造模成功的58只PD大鼠隨機分為模型組、美多芭組(50 mg·kg－1，ig)、MLR低(125 mg·kg－1，ig)、中(250 mg·kg－1，ig)、高劑量(375 mg·kg－1，ig)組，另取手術并注射生理鹽水，經檢測無旋轉運動的大鼠10只為假手術組，模型組10只，其他每組各12只，共6組。分組后即給予相應藥物，假手術組與模型組大鼠灌胃給予蒸餾水2 ml，每日1次，連續(xù)3周。

1.2.4 行為學檢測 模型動物分組后每隔7 d進行旋轉行為檢測。于給藥后30 min給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)誘發(fā)旋轉，記錄40 min 內的旋轉次數(方法同“1.2.2”)。

1.2.5 大鼠肌電測定 清醒大鼠固定于實驗臺上，使用BL-420E+生物信號采集器記錄肌電。將肌電記錄電極固定在大鼠右側臀部肌肉，電極間隔約1 cm，參考電極接地，記錄震顫引起的肌電活動(electromyography，EMG)，震顫的程度采用EMG頻率和幅度表示。分別記錄1 min內大鼠震顫的頻率和幅度，共3次，取平均值。

1.2.6 免疫組織化學檢測 每組取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉后開胸，動脈插管，以生理鹽水沖洗血液后灌注含0.04多聚甲醛的0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2 ～7.4)固定組織，斷頭取全腦固定4 h，以含0.3的蔗糖的多聚甲醛固定液內脫水，待組織下沉后修整組織塊，取中腦腹側作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為20 μm。切片首先與一抗(TH，1 ∶500;DAT，1 ∶200;GFAP，1∶400)4℃孵育過夜;然后分別與生物素標記的二抗(1∶300)反應1 h以及卵白素－生物素復合物反應2 h，最后用含有DAB的緩沖液顯色。

神經元計數方法:隨機選取每只大鼠腦切片5張，分別在右側黑質(substantia nigra，SN)陽性細胞密集區(qū)中央部分取4個互不重疊的高倍視野，計數視野內TH、DAT、GFAP免疫反應陽性神經元數目。

1.2.7 外周神經傳導速度測定 另取正常大鼠18只，隨機分為3組，每組6只，0.1的水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻醉，俯臥固定。分離坐骨神經干，刺激電極置于游離的坐骨神經干近心端;引導電極置于坐骨神經干遠心端，兩電極相距約1 cm。采用BL-420E+型生物機能實驗系統(tǒng)，刺激信號0.6 mv，0.02 ms，單刺激，信號記錄采集間隔為0.01 s，1 kHz濾波，引導信號放大50倍，計算神經肌肉動作電位潛伏期，神經傳導速度計算公式為:

V=刺激電極到引導電極的距離(mm)/潛伏期(ms)。

將0.1 g·L－1的普魯卡因溶液(Procaine)和0.1 g·L－1的MLR溶液直接滴在坐骨神經上，觀察藥物對坐骨神經信號傳導速度的影響，以生理鹽水組(normal saline，NS)作為對照組。每5 min給予一次電刺激并記錄電信號傳導速度，記錄30 min。

2 結果

2.1 行為學觀察 假手術組大鼠無異常行為，模型組大鼠可見活動明顯減少、反應遲鈍、肢體震顫、嗅探、偏斜、弓背、尾僵直、豎毛等異常行為。給予美多芭2 h內大鼠僵住行為明顯，隨后緩解，給藥一段時間后大鼠的異常行為有所改善;MLR各給藥組大鼠在給藥后沒有僵住行為產生，持續(xù)給藥可改善模型大鼠出現(xiàn)的上述異常行為。

以APO誘導大鼠旋轉，其中，假手術組大鼠旋轉圈數無變化;模型組大鼠測定旋轉圈數維持360 r/40 min左右，美多芭(madopar)組于給藥后第1周旋轉圈數有所增加，其后2周恢復到給藥前水平，大鼠運動變化給藥前后差異無顯著性;MLR低、中、高劑量組給藥后大鼠旋轉圈數也無差異。各組大鼠給藥前后旋轉情況見Fig 1所示。

Fig 1 Rotational behavior in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.2 肌電活動 假手術組大鼠靜息狀態(tài)EMG無明顯可檢測信號，模型組大鼠可見連續(xù)的陣發(fā)性簇狀電信號(P＜0.01)，其節(jié)律與大鼠震顫活動的節(jié)律相一致，表現(xiàn)出PD模型大鼠的特殊癥狀特征。各給藥組給藥前EMG值與模型組無差異，給藥后40 min，與模型相比，陣發(fā)性簇狀電信號出現(xiàn)的頻率和幅度均明顯降低，且具有劑量依賴性;其中，MLR中、高劑量組改善模型動物震顫的作用優(yōu)于陽性對照藥美多芭組(Fig 2)。

Fig 2Tremor in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.3 免疫組織化學分析

2.3.1 大鼠損毀側黑質TH表達 假手術組大鼠SN的TH免疫陽性神經元形態(tài)清晰，TH表達高，免疫活性強，細胞胞體和纖維染色較深，有明顯可見的免疫陽性突起;6-OHDA偏側損傷大鼠毀損側SN TH免疫陽性神經元的數目較假手術組下降95%(P＜0.01)，免疫活性差，胞質著色淡，細胞輪廓不清晰。MLR各給藥組神經元數目較模型組有所增加，中、高劑量組的作用與陽性對照藥美多芭相似(P＜0.01)，TH免疫陽性神經元的數目較模型組增加，MLR高劑量組TH免疫陽性神經元的數目約為模型組的499.14%(Fig 3)。

A:Representative photographs showing.sham(a)，6-OHDA(b)，6-OHDA+madopar(c)，6-OHDA+MLR(125mg·kg－1)(d)，6-OHDA+MLR(250 mg·kg－1)(e)，6-OHDA+MLR(375 mg·kg－1)(f);B:Summary of the effect of MLR on 6-OHDA induced TH immunoreactive neurons in the SN.＊＊P＜0.01 vs sham group，##P＜0.01 vs 6-OHDA group

2.3.2 大鼠損毀側黑質DAT表達 DAT主要位于神經元軸突和末梢的質膜上。假手術組DAT表達高，免疫活性強，胞質濃染，細胞輪廓較清晰。模型組DAT表達明顯降低(P＜0.01)，免疫活性差，胞質著色淺，細胞形態(tài)模糊。各給藥組均可改善6-OHDA所致DAT免疫陽性神經元數目的減少，MLR作用好于陽性對照藥美多芭，但差異未見顯著性(P＞0.05)(Fig 4)。

Fig 4 DAT positive neurons immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.3.3 大鼠損毀側黑質GFAP表達 假手術組GFAP表達較低，胞質著色淡，模型組GFAP表達顯著增加(P＜0.01，比假手術組增加了188.59%)，胞質著色加深，各給藥組均可降低GFAP免疫陽性星形膠質細胞的數目(P＜0.01)，MLR高劑量組GFAP免疫陽性星形膠質細胞的數目比模型組降低了43.68%(Fig 5)。

Fig 5 GFAP positive astrocyte immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.4 外周神經傳導速度 在給予生理鹽水時，大鼠坐骨神經傳導速度保持在0.4～0.8 m·s－1之間;而給予普魯卡因溶液5 min，坐骨神經傳導速度迅速增加，然后傳導速度明顯下降。給予MLR后，神經傳導速度沒有變化，提示MLR可能對神經傳導速度沒有影響(Fig 6)。

Fig 6 The peripheral nerve conduction velocity in normal rats(±s，n=6)

3 討論

靜止性震顫是PD主要臨床特征之一。目前認為，PD患者靜止性震顫主要與基底神經節(jié)－丘腦－皮層傳遞環(huán)路有關。黑質－紋狀體多巴胺能神經纖維變性使這一環(huán)路中具有節(jié)律性放電活動的神經元活動增強并同步化，最后通過運動皮質的節(jié)律性興奮而產生震顫。目前，臨床針對靜止性震顫主要采用DA替代療法、抗膽堿藥物、選擇性乙酰膽堿受體拮抗劑等進行治療，由于不良反應明顯、難以控制疾病病理進程等原因，亟需研發(fā)療效明顯、毒副作用小的抗 PD 藥物［1，7－8］。

本研究結果顯示，MLR各給藥組大鼠旋轉圈數在給藥前后沒有變化，與模型組相比差異也無顯著性，表明MLR對APO誘導的大鼠旋轉運動沒有影響，提示MLR抑制震顫的作用不是通過多巴胺受體產生的。行為學觀察證實，MLR對大鼠的運動障礙有改善趨勢。但是，目前還缺少可靠的量化指標對運動障礙進行評價。本研究首次將EMG檢測用于評價PD模型大鼠的震顫程度。結果表明，美多芭和MLR各劑量對大鼠震顫頻率和幅度有明顯的抑制作用，且MLR各給藥組具有良好的量效關系。該檢測方法的建立為抗PD藥物藥效學研究與作用機制考察提供了更有效的評價技術。

靜止性震顫即可以是中樞性震顫也可以是外周性震顫。在減輕震顫方面，MLR是否直接抑制外周神經傳導速度，目前仍不清楚。因此，考察了MLR對正常大鼠外周神經傳導速度的影響。實驗結果表明MLR抑制大鼠震顫與外周神經沒有直接關系。

本研究中，6-OHDA定位注射造成黑質星形膠質細胞數目增多，這與已有的研究報道一致。隨著病程的進展，激活的星形膠質細胞釋放大量促炎因子導致神經元變性死亡［9－10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素和蘆丁的神經保護作用均與其抗氧化、抗炎作用相關［3－6］。本實驗顯示，MLR可明顯增加TH 陽性細胞數目，并改善細胞狀態(tài)。另外，GFAP陽性計數與TH陽性計數相關性分析顯示，GFAP細胞數與TH細胞數呈負相關，表明星形膠質細胞反應性增生與DA能神經元凋亡有關，而MLR可明顯降低GFAP陽性細胞數，提示MLR能夠抑制星形膠質細胞釋放促炎因子。

在PD發(fā)病過程中，各種損傷因素最終通過引起神經細胞損傷及凋亡導致功能障礙，到目前為止還沒有任何一種藥物或治療方式能夠完全阻斷PD的進程。本研究證實，連續(xù)給藥3周，MLR可以劑量依賴性減輕大鼠震顫頻率和幅度，表明MLR在減輕模型動物震顫方面具有獨特的優(yōu)勢。此外，MLR能夠減輕6-OHDA造成的DA能神經元損傷、抑制星形膠質細胞釋放促炎因子，部分恢復DA能神經元功能，延緩PD病理進程。本研究為其進一步臨床應用提供了重要的基礎實驗數據。

(致謝:感謝Thomas P.Lahey先生和 SYNORx，Inc公司提供實驗樣品及在研究過程中給予的幫助。)

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