高 偉，馬 麗，張洪菊，張玉娟，常國強，王 建，李華文，龐天翔

(中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院、血液學研究所、血液病醫(yī)院，實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020)

血管生成不僅在實體腫瘤中，而且在血液惡性腫瘤中發(fā)揮非常重要的作用［1］。在急性髓系白血病和急性淋系白血病骨髓標本中可以觀察到明顯的血管密度增加［2－3］。血管生成是受正性和負性調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)的，通過這兩類因子的相互平衡來維持正常的血管生成［4］。當這種平衡被破壞，促血管生成因子占主導時便發(fā)生病理性血管新生從而促進腫瘤的發(fā)生。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最常見的強力促血管生成因子，在腫瘤血管新生中發(fā)揮重要的作用。鈉氫交換蛋白1(NHE1)是一種在哺乳動物中廣泛表達的膜蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的pH值(pHi)。越來越多的實驗表明鈉氫交換蛋白蛋白1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5－8］。其新的抑制劑 cariporide具有更高的特異性和相對較小的毒副作用，已經(jīng)被加拿大和美國用于治療心肌缺血/再灌注損傷［9］。本研究通過觀察cariporide處理后K562上清液對臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及成管能力的影響，探討其在K562細胞誘導血管生成方面的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 K562細胞由本實驗室保存;RPMI 1640培養(yǎng)液為 Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清和M199培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;cariporide購自Sigma公司;Transwell小室購自Millipore公司;Matrigel(生長因子減少型)購自BD公司;雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)熒光染料和尼日利亞菌素(Nigericin)均購于Calbiochem公司;人VEGF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自R＆D公司。

1.2 儀器 Forma 371型恒溫培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品;CK型倒置光學顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;激光掃描共焦顯微鏡(TCS SP2)為德國LEICA公司產(chǎn)品;Synergy H4型酶標儀為美國Biotek公司產(chǎn)品。

1.3 K562上清液的制備及ELISA檢測 取對數(shù)生長期的K562細胞1.5×106加于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入或者不加入10 μmol·L－1的 cariporide，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，離心收集上清液備用。按照ELISA試劑盒說明書分別檢測兩種上清液中VEGF的含量。

1.4 HUVEC 細胞的培養(yǎng)參照Jeffe等［10］的方法用0.3%的胰酶消化臍靜脈內(nèi)皮，將收集的細胞加于M199培養(yǎng)基中，其中含20%胎牛血清、青霉素(100 kU·L－1)鏈霉素(100 mg·L－1)，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測cariporide對K562細胞上清液誘導的HUVEC增值的影響 取對數(shù)生長期的HUVEC，按每5×103接種于96孔板中，分別加入1∶1的cariporide處理和不處理的K562細胞上清液和M199培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，加入5 g·L－1的 MTT工作液每孔20 μl，孵育4 h，離心后棄上清，加入 DMSO每孔100 μl，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，使用酶標儀在波長570 nm時檢測吸光度值，實驗重復3次。

1.6 Transwell檢測cariporide對K562細胞上清液誘導的HUVEC遷移的影響 HUVEC細胞以1×109·L－1的密度重懸在無血清的 M199培養(yǎng)液中，以100 μl體積接種于 transwell小室的上室，下室加入500 μl的1∶1的cariporide處理和不處理的K562細胞上清液和M199培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的非遷移細胞，倒置，風干，用0.1%結(jié)晶紫對小室背面遷移的細胞進行染色，PBS洗凈多余染液。33%醋酸脫色，分光光度計測定吸光值。

1.7 基質(zhì)膠血管形成法檢測cariporide對K562細胞上清液誘導的HUVEC成管的影響 將基質(zhì)膠在4℃融化過夜，按照每孔50 μl加入96孔板中，37℃孵育30 min使之凝固。將HUVEC重懸在1∶1的cariporide處理和不處理的 K562細胞上清液和M199培養(yǎng)液中，每孔加入150 μl含有1×104HUVEC細胞的的細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h觀察血管形成，并在40倍顯微鏡下拍照記錄。

1.8 細胞內(nèi) pH值測定 參照王若君等［11］的方法，分別檢測Cariporide處理前后K562細胞的細胞內(nèi)pH值。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 cariporide對K562上清液誘導的HUVEC增殖的影響 MTT檢測結(jié)果顯示(Fig 1)，cariporide處理組的OD值與對照組的OD值比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，cariporide明顯抑制 K562細胞上清液誘導的HUVEC增殖。

2.2 Cariporide對 K562上清液誘導的 HUVEC遷移的影響 Transwell實驗顯示(Fig 2)，cariporide處理明顯抑制K562細胞上清液誘導的HUVEC遷移，實驗組的OD值與對照組OD值比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 Cariporide對K562上清液誘導的 HUVEC成管能力的影響 Fig 3結(jié)果顯示，cariporide處理組與對照組相比，HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)分支數(shù)量和長度均減少，cariporide明顯抑制K562細胞上清液誘導的HUVEC成管能力。

2.4 Cariporide對K562細胞內(nèi)pH的影響 Cariporide處理后，K562細胞的細胞內(nèi)pH由7.12±0.07下降到6.95±0.08，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.5 Cariporide對K562分泌VEGF能力的影響ELISA結(jié)果顯示(Fig 4)，cariporide處理后，K562細胞分泌VEGF能力明顯下降(P＜0.05)。

Fig 1 Effect of CM from cariporide treated K562 cells on HUVEC proliferation(±s，n=5)

Fig 2 Effect of CM from cariporide treated K562 cells on HUVEC migration(±s，n=5)

Fig 3 Effect of cariporide on HUVECs in vitro tube formation

Fig 4 Inhibitory effect of cariporide treatment on the secretion of VEGF(±s，n=5)

3 討論

所有的實體腫瘤生長都需要經(jīng)歷沒有血管支持的和隨后的需要血管支持的兩個階段。由于血液惡性腫瘤主要是在骨髓和淋巴器官積累，所以人們最初以為血管生成對于血液惡性腫瘤并不是不可或缺的。然而，由于骨髓和淋巴結(jié)血管密度增加有助于為惡性細胞提供營養(yǎng)和氧氣，骨髓的內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞可以以旁分泌的方式分泌細胞因子和生長因子為惡性細胞的增殖和存活提供支持。越來越多的臨床研究表明血管生成與血液惡性腫瘤的疾病進展，診斷以及預后息息相關(guān)。鈉氫交換蛋白1(NHE1)是一種在哺乳動物中廣泛表達的膜蛋白，之前的研究表明NHE1在髓系白血病細胞系中高度激活以維持細胞內(nèi)堿性的pH值［12］。

腫瘤血管生成是由內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞與其微環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化是新生血管形成過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，VEGF在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用［13－14］。我們的實驗結(jié)果表明，應用NHE1特異性的抑制劑cariporide處理后，K562細胞上清液對HUVEC的增殖、遷移、分化的誘導作用都明顯下降。Cariporide是一種毒副作用很小的特異抑制劑，其IC50在0.03－3.4 mmol·L－1，我們實驗室之前的研究結(jié)果表明在本實驗中采用的10μmol·L－1濃度對K562細胞基本沒有細胞毒性，cariporide處理后引起這種抑制作用的原因是cariporide抑制NHE1的鈉氫交換活性，造成細胞內(nèi)酸化，從而引起VEGF的分泌減少。

綜上所述，應用NHE1特異性抑制劑cariporide可以抑制K562細胞上清液誘導血管生成的能力。這種抑制作用主要是通過降低細胞內(nèi)pH值和減少VEGF分泌引起的。本研究有助于進一步了解血液惡性腫瘤血管生成的機制，為臨床上的預防和治療提供理論基礎(chǔ)。

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