宋 楊，孫嫵弋，胡姍姍，汪慶童，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230032)

肝纖維化是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理變化，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。肝纖維化的主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)的過量沉積［1］。目前認(rèn)為，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化ECM的主要來源細(xì)胞。HSC在多種因素刺激后被激活轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖，合成ECM，并在肝內(nèi)過量沉積，發(fā)生肝纖維化［2］。促進(jìn)活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的重要途徑，HSCs的凋亡被認(rèn)為是肝纖維化自我修復(fù)的中心環(huán)節(jié)。凋亡途徑不但可以減少增生活化的HSC數(shù)量，使ECM分泌減少，而且凋亡的細(xì)胞可在數(shù)小時(shí)內(nèi)被周圍的細(xì)胞所吞噬，很少引起微環(huán)境的炎癥損傷，是一種理想的清除增生HSC的方式［3］。

β-arrestins對(duì)絕大部分G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究表明，β-arrestin除了調(diào)節(jié)GPCR信號(hào)通路以外，β-arrestin作為調(diào)節(jié)分子也在其他多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用［4－5］。有研究表明，β-arrestin2 在細(xì)胞增殖中起重要調(diào)節(jié)作用［6－7］，β-arrestin2 還有抗細(xì)胞凋亡的作用，其能通過多種信號(hào)通路介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［8－9］。然而，β-arrestin2 對(duì)肝纖維化 HSC 凋亡的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題組在肝纖維大鼠的肝組織中β-arrestin2表達(dá)明顯增強(qiáng)的先前研究基礎(chǔ)上(另文發(fā)表)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將體外合成的靶向 β-arrestin2的小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)導(dǎo)入肝星狀細(xì)胞株HSC-T6中，選擇性沉默β-arrestin2基因，觀察其對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)和HSC凋亡的影響，初步探討siRNA β-arrestin2促HSC凋亡作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 HSC-T6細(xì)胞為永生化大鼠肝星狀細(xì)胞株，由上海肝病中醫(yī)藥研究所提供。

1.2 主要材料與試劑 Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;抗 β-arrestin2抗體:購自 Santa cruz公司;抗 Bcl-2、Bax、β-actin 抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn):MBI Fermentas公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L):北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;氟化聚偏乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)微孔轉(zhuǎn)移膜:Millipore公司;SuperSignal West Femto Kit(超敏感底物發(fā)光試劑盒):Pierce公司，4℃保存。所有siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。RT-PCR引物由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成;DMEM、FBS:GIBco公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒:Fermentas公司產(chǎn)品;凋亡試劑盒:貝博生物公司。

1.3 儀器 Olympus IX-71型光學(xué)顯微鏡(日本);流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司，F(xiàn)C500型);SpotAdvanced顯微攝像系統(tǒng)(美國);電泳儀(DYY-10，北京六一儀器廠);Image-Pro plus圖像處理系統(tǒng);PCR儀(美國Biorad公司，My Cycler)。

2 方法

2.1 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 HSC-T6細(xì)胞采用含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中。

2.2 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞株

2.2.1 靶向 β-arrestin2的 siRNA設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)β-arrestin2全基因序列設(shè)計(jì)4個(gè)siRNA序列如下:siRNA-1:正義鏈 5'-AGCGUGACUUUGUGGAUCATT-3'， 反 義 鏈 5'-UGAUCCACAAAGUCACGCUTT-3';siRNA-2:正義鏈5'-GACCGGAAAGUGUUUGUGATT-3'，反義鏈 5'-UCACAAACACUUUCCGGUCTT-3';siRNA-3:正義鏈5'-GACCGACUGCUGAAGAAGUTT-3'，反義鏈5'-ACUUCUUCAGCAGUCGGUCTT-3';siRNA-4:正義鏈 5'-UCGAGCCUUCUGUGCCAAATT-3'，反義鏈 5'-UUUGGCACAGAAGGCUCGATT-3'。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分3組:(1)空白對(duì)照組，以等體積的無牛血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液代替轉(zhuǎn)染液，作為轉(zhuǎn)染前β-arrestin2水平;(2)陰性對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染scrambled RNA的細(xì)胞觀察β-arrestin2表達(dá)的變化;(3)siRNA β-arrestin2 組(R1、R2、R3、R4)，轉(zhuǎn)染針對(duì)β-arrestin2的siRNA，特異性干擾目的基因β-arrestin2的表達(dá)。

2.2.3 轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞至細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用無牛血清無雙抗培養(yǎng)液分別稀釋Lipofectamine 2000和siRNA至所需濃度(siRNA終濃度為20 μmol·L－1，分裝，－20℃保存)，室溫靜置 5 min。將稀釋后的siRNA與Lipofectamine 2000小心混勻，室溫再靜置20 min，使形成穩(wěn)定的siRNA-脂質(zhì)體混合物。隨后棄去培養(yǎng)液，將上述混合物加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 RT-PCR檢測 β-arrestin2 mRNA的表達(dá) 使用TRizol試劑提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR引物為 β-arrestin2:5'-CCACGTCACCAACAATTCTG(上游)，5'-TTGGTGTCTTCGTGCTTGAG-3'(下游);內(nèi)參 GAPDH 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'(上 游)，5'-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3'(下游)。PCR條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 30 s;72℃ 10 min;4℃ 10 min(循環(huán)30次)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 Western blot檢測 β-arrestin2、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，加蛋白裂解液抽提細(xì)胞蛋白。Lowry法蛋白定量，每泳道20 μl蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE，在轉(zhuǎn)移緩沖液中，以200 mA的電流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。后封閉2 h，再加入抗β-arrestin2、Bcl-2、Bax單抗，4℃孵育過夜。洗滌后，繼以辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯色。用Image-Pro plus圖像處理系統(tǒng)分析計(jì)算蛋白印跡值。

2.5 細(xì)胞凋亡的檢測 采用AnnexinV/PI雙染色法。消化收集各組細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞。按照試劑盒說明進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。圖中右上象限為凋亡晚期或壞死細(xì)胞區(qū)，左下象限為活細(xì)胞區(qū)，右下象限為早期凋亡細(xì)胞區(qū)。測定3次，計(jì)算各組細(xì)胞的平均凋亡率。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析比較各組間差異。

3 結(jié)果

3.1 siRNA β-arrestin2 對(duì) β-arrestin2 基因表達(dá)的抑制作用 RT-PCR結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參照比較分析后顯示，在轉(zhuǎn)染siRNA3后HSC-T6 βarrestin2 mRNA較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組mRNA水平分別下降70% ±1.76%和69% ±1.93%，而在轉(zhuǎn)染siRNA1、siRNA2和siRNA4后mRNA下降不明顯。提示 siRNA3 β-arrestin2 對(duì) β-arrestin2 mRNA表達(dá)有抑制作用。陰性對(duì)照組灰度與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Fig 1。

3.2 siRNA β-arrestin2 對(duì) HSC-T6 細(xì)胞 β-arrestin2蛋白表達(dá)的抑制作用 Western blot分析結(jié)果顯示，HSC-T6在轉(zhuǎn)染siRNA2和siRNA3后β-arrestin2蛋白表達(dá)被抑制了29.00% ±1.68%和68.43% ±2.88%，而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞的β-arrestin2蛋白表達(dá)無明顯變化，與 β-arrestin2 mRNA下降趨勢基本相同(見Fig 2)。

Fig 1 Transcriptional expression of the β-arrestin2 in the stable HSC-T6 cells transfected with β-arrestin2 siRNA

Fig 2 Protein level of the β-arrestin2 in the HSC-T6cells transfected with β-arrestin2 siRNA

3.3 siRNA β-arrestin2 對(duì) HSC Bcl-2 和 Bax 表達(dá)的影響 Fig 3結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA3的HSC-T6細(xì)胞β-arrestin2 Bcl-2表達(dá)被抑制了32.58% ±3.46%(P＜0.01)，Bax的表達(dá)增加了38% ±3.72%(P＜0.01)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞比，Bcl-2和Bax表達(dá)無變化。

Fig 3 Effects of silencing HSCs β-arrestin2 gene on the expression of Bcl-2，Bax

3.4 siRNA β-arrestin2 對(duì) HSC-T6 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析表明，正常組細(xì)胞的凋亡率為3.5%，陰性對(duì)照細(xì)胞的凋亡率為4.7%。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染siRNA β-arrestin2處理組細(xì)胞凋亡率明顯增加達(dá)37.5%(Fig 4)。

4 討論

HSC的激活及ECM的大量產(chǎn)生是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，因此，尋找促進(jìn)HSC凋亡的途徑是防治肝纖維化的重要策略。大多數(shù)研究表明［10－11］，活化的HSC主要通過凋亡途徑消除，是纖維化消退的主要機(jī)制。Bcl-2基因家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2基因家族中重要的凋亡促進(jìn)基因，其基因產(chǎn)物Bcl-2、Bax是重要的凋亡調(diào)控蛋白。Bcl-2和Bax互為負(fù)相關(guān)，Bcl-2/Bax比例高低決定了細(xì)胞凋亡的方向即抑制凋亡或是促進(jìn)凋亡［12－13］。

Arrestins是一種分子量為48～55 ku的可溶性蛋白。在脊椎動(dòng)物中，Arrestins家族包括兩種僅表達(dá)在視網(wǎng)膜桿狀和錐狀體感光細(xì)胞的Arrestin 1、Arrestin 4，和廣泛表達(dá)于各組織的β-arrestins，包括βarrestin1和β-arrestin2(也稱作Arrestin 2和Arrestin 3)。β-arrestins為多功能蛋白，不僅能引起GPCRs的脫敏和內(nèi)吞以調(diào)節(jié)GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可以調(diào)節(jié)其他一些非GPCRs跨膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，凋亡等多種功能活動(dòng)［14－16］。本課題組先前研究了β-arrestins在大鼠肝纖維化發(fā)展過程中的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的發(fā)展，β-arrestin2表達(dá)明顯增加，而β-arrestin1表達(dá)無明顯變化。結(jié)果提示β-arrestin2在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

Fig 4 Effects of siRNA β-arrestin2 on the apoptosis of HSC-T6

β-arrestin2不僅參與調(diào)節(jié)GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且作為支架蛋白調(diào)節(jié)許多信號(hào)通路發(fā)揮其抗凋亡的作用［17－18］。有研究表明在非活化和活化的CD4+T細(xì)胞中β-arrestins促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)［19］。另有研究表明［20］，在DEN誘發(fā)的小鼠肝癌模型中，肝臟 βarrestin2表達(dá)明顯增加，其可能通過增加Bcl-xL和減少Bax的表達(dá)，抑制p53導(dǎo)致抗凋亡作用。p53的激活的下游信號(hào)通路涉及許多細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，有Bcl-xl(抗凋亡，Bcl-2的家庭成員)，Bax(促凋亡)，p53的凋亡調(diào)節(jié)作用是通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2或Bcl-xL等實(shí)現(xiàn)的，通過他們的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞線粒體的通透性，從而影響著下游的促凋亡基因的功能［21－22］。β-arrestin2 可能通過調(diào)節(jié)MDM2蛋白的亞細(xì)胞定位，β-arrestin2的低聚物可以調(diào)節(jié)p53的功能［23］，因此β-arrestin2可能通過影響p53的功能，繼而影響細(xì)胞增殖和凋亡等功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 siRNA β-arrestin2轉(zhuǎn)染HSC后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因蛋白表達(dá)下調(diào)，而Bax基因表達(dá)上調(diào)，表明β-arrestin2干擾具有影響兩種凋亡因子介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的作用。通過流式細(xì)胞儀檢測 AnnexinV/PI雙染細(xì)胞凋亡，顯示轉(zhuǎn)染siRNA β-arrestin2的HSC-T6細(xì)胞凋亡率明顯上升。以上研究結(jié)果提示β-arrestin2干擾能通過改變活化HSC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。因此，siRNA介導(dǎo)的β-arrestin2沉默可能對(duì)肝纖維化具有潛在治療前景。

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