趙大強 陳立中 李軍 邱江

胸腺是中樞性免疫器官，發(fā)揮對T淋巴細胞的選擇發(fā)育功能。胚胎豬胸腺可以選擇發(fā)育人造血干細胞，通過胸腺移植，可使供體的胸腺在受體體內(nèi)選擇發(fā)育受體T淋巴細胞從而誘導受體對供體特異性免疫耐受[1-2]。已有的研究表明胸腺對免疫耐受的形成是至關重要的[3-8]。在應用異體胸腺組織移植來誘導免疫耐受時，由于胸腺富含供體組織抗原，導致移植的胸腺受到強烈排斥而引起免疫耐受誘導失敗，因此受體術前去胸腺是必要的。即便如此，胸腺組織移植仍不能誘導免疫耐受的穩(wěn)定形成，但如果把胸腺作為一個帶血管器官來移植則能更好地誘導免疫耐受的形成。為了達到這一目的，已有的研究嘗試了兩種非常有創(chuàng)意的途徑，一是“胸腺腎（thymokidney，TK）”移植[9-11]，二是帶血管的 “胸腺小葉”移植[12-15]，均取得了良好的效果。小型豬構建TK術后60d移植胸腺組織能恢復正常的結構，并支持胸腺細胞的發(fā)育[16]，但TK在移植之前其胸腺功能如何還沒有報道。本研究嘗試用大鼠建立了自體TK模型，并觀察在進行TK移植之前移植胸腺的功能。

材料和方法

一、實驗動物及麻醉方法

SD大鼠32只，雄性，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。麻醉采用10﹪水合氯醛0.3ml/100 g腹腔注射。

二、手術設備

小動物呼吸機TKR-200C（江西特力麻醉呼吸設備有限公司）1臺、氧氣瓶、手術顯微鏡（SXP-1B，上海醫(yī)用光學儀器廠），顯微器械及普通手術器械，流式細胞儀等。

三、實驗分組及手術方法

1.Ⅰ組：去胸腺組（12只，體質(zhì)量150～250 g）。沿頸中線剪開皮膚及皮下組織，氣管插管，小動物呼吸機連接氧氣瓶支持大鼠呼吸。于胸骨柄中點剪開胸骨1.5～2 cm，暴露胸腺表面、胸膜和兩側(cè)肺上極，顯微鏡下直接撕破雙側(cè)胸膜上極，從底部翻起左右胸腺兩葉，向上游離去除胸腺。仔細檢查并摘除殘留胸腺，止血完畢，前縱隔放置引流管關閉胸腔。脫機后吸盡氣管滲液，縫合氣管，縫合皮膚后負壓吸引引流管片刻后拔掉引流管。2個月后隨機選取5只長期存活大鼠加去脾臟手術作為第Ⅳ組。

2.Ⅱ組：TK組（15只，體質(zhì)量150～250 g）。在Ⅰ組的手術基礎上繼續(xù)手術，摘除的胸腺放0～4℃生理鹽水中保存。沿劍突到恥骨聯(lián)合上取腹正中切口，暴露左腎，在左腎表面中下1/3處用顯微無齒鑷輕輕橫行撕開約0.5 cm腎包膜，用鑷子探進腎包膜下進行適當游離。把摘取的2胸腺兩葉從正中分開，取一葉剪成3～4片，主要在于剪薄，分別輕輕放入腎包膜內(nèi)，直到放滿整個腎包膜。相同的方法行右側(cè)腎包膜下自體胸腺移植，構建雙側(cè)自體TK。復位腸管，關閉腹腔。

3.Ⅲ組：假手術組（5只，體質(zhì)量50～100 g）。模仿Ⅱ組進行開胸、開腹、氣管插管通氣手術，開胸見到胸腺后并不撕破胸膜去除胸腺，撕破腎包膜后不行胸腺移植。

四、檢測、觀察指標

1.術 后 0、1、2、3、4、6、8、12及 16周，3組動物分別抽取外周血，使用流式細胞儀檢測外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞和CD4-CD8-T細胞所占的比例及變化情況。其中Ⅰ組在第8周時加去脾臟的5只大鼠加測10周時的流式檢測。

2.Ⅱ組術后2周、4周、6周、8周、3個月、4個月分別處死大鼠1～2只，顯微鏡下觀察雙側(cè)腎包膜下移植胸腺血管重建情況，留取標本，行組織形態(tài)學檢查。

五、統(tǒng)計學分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對各組不同時間點的流式檢測結果繪制均數(shù)線圖。PBMC不同分化T淋巴細胞所占平均比例用表示，術后3個月時流式檢測結果的組間差異采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

TK組術后2周已見到明顯有血管自腎門生長入腎包膜下的胸腺組織中，扇形分布，左側(cè)腎包膜下血供重建優(yōu)于右側(cè)，胸腺組織由移植時淤血顏色變成白色正常胸腺組織顏色，6～8周時移植胸腺組織增厚(圖1)，組織學檢查能見到正常胸腺組織結構（圖2）。撕破的腎包膜在14 d時已完全重建。

腎包膜下移植的胸腺3～4個月后逐漸退化，表現(xiàn)為移植的胸腺組織中淋巴細胞減少，逐漸為脂肪細胞替代（圖3）。

PBMC中不同分化T淋巴細胞的變化：（1）Ⅰ組和Ⅱ組術后6周內(nèi)流式檢測結果變化基本一致，6周后出現(xiàn)明顯的分化，表現(xiàn)為Ⅰ組CD4-CD8-T淋巴細胞比例仍持續(xù)上升，在第8周Ⅳ組中升高得更明顯，而Ⅱ組6周后開始逐漸下降（圖4a，表1）。Ⅰ組成熟的單陽性（CD4+T和CD8+T）淋巴細胞在術后6周后繼續(xù)下降，而Ⅱ組開始回升（圖4b、4d；表 2、3）。Ⅰ組 CD4+CD8+T淋巴細胞在術后6周后仍有波動，后續(xù)的檢測顯示呈低水平，而Ⅱ組6周后較平穩(wěn)（圖4c，表4）；(2)Ⅲ組與實驗組Ⅰ、Ⅱ在術后早期就呈現(xiàn)明顯差異，但能看到術后1～3周內(nèi)雙陰性T淋巴細胞比例是下降的，成熟的單陽性細胞逐漸恢復正常，雙陽性T淋巴細胞所占比例明顯高于實驗組（圖 4） ；(3)去胸腺后 1～3周內(nèi)，CD4+T 淋巴細胞先上升后回降，CD8+T淋巴細胞先下降后回升（圖4b、4d）。術后12周，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅳ組之間PBMC中CD4-CD8+T淋巴細胞的比例分別 為（56.4±5.2）﹪、（38.4±5.4）﹪、（60.7±7.7）﹪（F=46.486,P=0.000）；CD4+CD8-T 淋 巴細胞比例分別為（0.7±0.2）﹪、（1.1±0.2）﹪、（1.2±0.7）﹪（F=6.820,P=0.004）；CD4-CD8+T淋巴細胞比例分別為（17.8±5.1）﹪、（24.4±8.2）﹪、（10.3±3.7）﹪（F=9.069，P=0.001）.而其余時間各組間各類T淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 胸腺腎移植組術后2周及8周大鼠左右胸腺腎情況，圖a為術后2周大鼠左胸腺腎；圖b為術后2周大鼠右胸腺腎；圖c為術后8周大鼠左胸腺腎；圖d為術后大鼠右胸腺腎

圖2 胸腺腎移植組術后2周及8周胸腺腎組織學檢查情況，圖a為術后2周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50）；圖b為術后2周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200）；圖c為術后8周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50倍）；圖d為術后8周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200）

圖3 圖a為術后16周大鼠胸腺腎（×10）；圖b為術后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50）；圖c為術后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200倍）；圖d為術后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×400）

表1 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴細胞比例的變化（﹪，）

表1 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴細胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.1±7.047.3± 9.8 - 56.4±5.262.1±6.6Ⅱ 15 38.6±10.342.8±9.646.6±12.843.2±10.847.1±8.048.3±4.045.5±11.1 - 38.4±5.4 -Ⅲ 5 46.8± 8.748.6±8.338.0± 6.736.6± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.0±7.047.3± 9.854.0±5.360.7±7.7 -F值 0.808 1.041 0.549 2.970 0.010 0.925 0.118 46.486 P值 0.498 0.388 0.652 0.046 0.990 0.408 0.889 0.000

表2 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴細胞比例的變化（﹪，）

表2 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴細胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.5 - 25.1± 3.123.3±1.1Ⅱ 15 31.2±8.238.4±5.332.5± 7.428.7± 9.833.4±2.831.4±6.934.6±8.3 - 36.3±13.4 -Ⅲ 5 36.9±6.032.6±4.137.6±11.039.1±10.4 - - - - - -Ⅳ 5 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.530.0±1.528.0± 3.8 -F值 1.371 1.571 1.423 2.976 9.197 3.401 2.690 4.781 P值 0.269 0.215 0.254 0.046 0.001 0.047 0.085 0.016

表3 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴細胞比例的變化（﹪，）

表3 術后不同時間各組大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴細胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細胞，

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.9 - 17.8±5.1 14.0±5.2Ⅱ 15 29.0± 8.617.1± 7.019.3±11.226.8±20.117.5± 7.519.4±8.818.9±8.0 - 24.4±8.2 -Ⅲ 5 14.7± 2.616.9± 4.422.7± 5.622.4± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.914.3±4.410.3±3.7 -F值 2.254 2.215 0.521 0.196 3.478 0.519 1.370 9.069 P值 0.100 0.105 0.671 0.898 0.044 0.601 0.270 0.001

表4 術后不同時間各組大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴細胞比例的變化（﹪，）

表4 術后不同時間各組大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴細胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 - 0.7±0.2 0.6±0.4Ⅱ 15 1.3±0.5 1.8±1.6 1.6±1.6 1.4±0.5 1.5±1.0 1.0±0.5 1.1±0.3 - 1.1±0.2 -Ⅲ 5 1.5±0.3 2.0±0.9 1.8±0.6 1.9±0.5 - - - - - -Ⅳ 5 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 1.5±0.9 1.2±0.7 -F值 1.273 1.411 0.722 0.619 1.353 2.536 0.106 6.820 P值 0.300 0.257 0.546 0.608 0.274 0.097 0.899 0.004

圖4 圖a為去胸腺組和胸腺腎組術后6周出現(xiàn)明顯的分化，表現(xiàn)為去胸腺組CD4-CD8- T淋巴細胞比例仍持續(xù)上升，在第8周加去脾臟組中升高得更明顯，而胸腺腎組6周后開始逐漸下降；圖b,d為去胸腺組成熟的單陽性（CD4+ T和CD8+ T）淋巴細胞在術后6周后繼續(xù)下降，而胸腺腎組開始回升；圖c為去胸腺組CD4+CD8+ T淋巴細胞在術后6周后仍有波動，后續(xù)的檢測顯示呈低水平，而胸腺腎組6周后較平穩(wěn)

討 論

成功誘導特異性免疫耐受是解決器官移植免疫排斥的理想方法，近年來，胸腺移植對器官移植免疫耐受的誘導作用引起人們的重視，研究顯示帶血管的胸腺移植比胸腺細胞或胸腺組織塊移植有更好的誘導免疫耐受作用，原因在于胸腺組織移植時在胸腺血供得到重建前有一個缺血期，導致移植胸腺損傷，還致敏了受體。而血管化的胸腺避免了這一時期，因此明顯改善了誘導免疫耐受的效果。本文首次報道了用大鼠構建胸腺腎以使胸腺血管化，并在行胸腺腎移植以前對移植胸腺的功能做了評估。該模型在免疫耐受研究領域有以下優(yōu)越性和應用前景：(1)大鼠腎移植模型已很成熟，應用廣泛，一人操作，研究成本和要求比小型豬低；(2)已有的胸腺腎研究側(cè)重于研究胸腺移植后誘導免疫耐受的效果，本模型在移植前進行胸腺功能評估，顯示大鼠胸腺腎移植時間應選在胸腺腎構建后6周左右，不用像小型豬需等到術后2～3個月[7-9]，3～4個月后大鼠胸腺腎中的胸腺已開始退化；(3)評估胸腺功能的經(jīng)典辦法是選擇在SCID小鼠或裸小鼠中進行胸腺移植[17]，本模型在去胸腺大鼠中進行胸腺功能評估，更能為下一步大鼠胸腺腎移植提供直接指導意義；(4)有學者報道了在大鼠體內(nèi)行帶血管的胸腺移植[18]，如果同時行其他器官移植，也達到了胸腺移植誘導免疫耐受時移植胸腺的同步血管化，但在大鼠這種小動物身上操作較難，要求高，不利于應用，本模型避免了這一缺點；(5)腎包膜局部血液供給豐富，手術操作簡單，移植物的變化（增生、萎縮、吸收、退化或排斥）易于通過手術開腹直接觀察，移植物也可便利地切取進行各種組織學檢查。

本研究對照組術后早期雙陽性T細胞在術后早期比例較高，考慮是由于正常功能的胸腺因為手術應激加強了對雙陰性T淋巴細胞成熟發(fā)育的結果。去胸腺后3周內(nèi)，CD4+T淋巴細胞先上升后回降，CD8+T淋巴細胞先下降后回升，這種變化考慮是由手術應激引起，是淋巴細胞對手術打擊的一種正常反應。在Ⅰ組中第8周加去脾臟組中也發(fā)現(xiàn)8周后的一段時間內(nèi)成熟的單陽性T淋巴細胞呈現(xiàn)類似變化也證實了這一點，只是這種反應沒有第一次手術時反應明顯，顯示出成熟淋巴細胞在沒有胸腺的情況下數(shù)量上仍然能對外界刺激作出一定反應，由此推測在沒有胸腺支持新生T淋巴細胞發(fā)育的情況下，定居在其它淋巴組織中的成熟T淋巴細胞的增殖反應對PBMC中成熟T淋巴細胞數(shù)量的維持發(fā)揮了重要作用，在大鼠去胸腺后隨訪到16周也沒見到單陽性T淋巴細胞下降到0，在加去脾臟后（脾臟是成熟T淋巴細胞定居的重要場所之一），雙陰性細胞進一步上升，單陽性細胞繼續(xù)下降也證實了這一點。在選取對照組時，大鼠年齡偏?。?0～100 g），這樣降低了和實驗組的可比性，但從中也發(fā)現(xiàn)，未成年期大鼠（< 100 g）CD4+/CD8+比值大于成年大鼠（150～250 g），導致線圖的起始值相差較遠，有文獻顯示正常大鼠CD4+/CD8+比值約為4:1，測定的結果沒有這么高，這可能與部分大鼠在胸腺腎構建完成關腹后取血有關，手術應激后導致CD8+T細胞升高。因為考慮到可比性降低，所以假手術組在4周后未再行流式檢測。線圖中Ⅰ、Ⅱ組在第10周的斷點是由實驗設計造成，該時間點未檢測造成數(shù)值缺失。Ⅳ組加測第10周是為了更詳細了解去脾臟的影響。去脾臟組證實了在阻斷胸腺選擇發(fā)育新生T淋巴細胞的情況下，外周成熟T細胞的擴增對PBMC中成熟T淋巴細胞數(shù)量的維持發(fā)揮了重要作用。

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