鄒險峰 ，吳修利 ，陳星 ，高長城 ，*

（1.長春大學 農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，吉林 長春 130022；2.長春大學 生物技術學院，吉林 長春 130022）

大豆球蛋白的水解研究

鄒險峰1，吳修利2，陳星1，高長城1，*

（1.長春大學 農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，吉林 長春 130022；2.長春大學 生物技術學院，吉林 長春 130022）

采用Nagano法從豆粕中分離大豆球蛋白，利用大豆蛋白改性酶解大豆球蛋白制備水解肽，以單因素試驗和正交試驗確定酶解最佳條件，通過高效液相法分析大豆球蛋白水解肽的分子量分布。結果顯示：在20 g/L的底物濃度下的最佳條件為酶和底物比10000 U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。大豆球蛋白水解肽主要為130 u～1000 u的短肽，占肽總量的86.5%，說明大豆球蛋白水解肽的均一性極高。

大豆球蛋白；大豆球蛋白水解肽；大豆蛋白改性酶

中國是大豆的故鄉(xiāng)，大豆不僅提供了豐富的大豆植物油，而且也是優(yōu)質的植物蛋白源。大豆蛋白質含量高達干重的40%，其中80%～88%為水溶性蛋白質，而球蛋白占水溶性蛋白質的94%，球蛋白主要由大豆球蛋白(glycinin)和 β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)組成，分別占大豆蛋白質總量的50%和33%。大豆蛋白質含有全部人體的8種必需氨基酸，且比例合理，賴氨酸含量可以與動物蛋白相媲美，是食品加工業(yè)的重要原料。研究表明，大豆蛋白水解肽具有更好的生物活性和營養(yǎng)價值，因此，對大豆蛋白質的利用已經(jīng)進入肽階段。目前大豆肽的生產(chǎn)方法主要有酶解法和微生物發(fā)酵法，其中以酶解法最為常用。酶解用酶主要包括動物蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶如木瓜蛋白酶菠蘿蛋白酶等；微生物蛋白酶如堿性蛋白酶、中性蛋白酶等。目前市售大豆肽均為大豆蛋白水解獲得，但由于大豆蛋白為混合蛋白質，得到的大豆肽成分繁雜，均一性較差。本研究采用先將大豆蛋白質分離純化的方法得到大豆球蛋白，采用了大豆蛋白改性酶作為水解酶，通過酶解大豆球蛋白制備大豆肽，對水解條件進行了優(yōu)化，并對水解肽的分子量分布進行分析，為大豆肽的生產(chǎn)提供了新的酶類，也為工業(yè)生產(chǎn)高品質的大豆肽提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

脫脂豆粕：吉林省通榆蛋白質廠；大豆蛋白改性酶：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白質分子量標準品（Holotransferrin，77000u；Apomyoglobin，16951u；Ribonuclease A，13700 u；Cytochrome C，12400 u）、肽分子量標準品（Gly-Tyr，239.2 u；Val-Tyr-Val，379.5 u；Leu-enkephal in，569.7u；Met-ekephalin，573.7u；Angiotensin Ⅱ，1296u）：美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FDU-2100型冷凍干燥儀：日本EYELA公司；J-26XP型高速冷凍離心機：美國BECKMAN COULTER公司；AlphaImager HP型凝膠成像系統(tǒng)：美國Alpha公司；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆球蛋白的分離和表征

大豆球蛋白的分離采用優(yōu)化的Nagano法[1]，表征采用SDS-PAGE還原電泳。

1.3.2 指標測定

蛋白酶活力測定采用福林法[2]；蛋白質含量測定采用凱氏定氮法[3]；水解度(the Degree of Hydrolysis,DH)的測定采用三氯乙酸(TCA)法[4]。

1.3.3 酶解工藝路線和酶解條件優(yōu)化

1.3.3.1 酶解工藝路線

大豆球蛋白→調(diào)漿→酶解→滅酶→酸沉→離心→上清液冷凍干燥

1.3.3.2 單因素試驗

以DH為指標研究不同的底物濃度、酶與底物比、水解時間、pH和溫度對大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的影響。

1.3.3.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇酶與底物比、酶解時間、酶解溫度和pH作為考察因素，采用正交表L9(34)進行正交試驗，以DH為考察指標，利用數(shù)據(jù)DPS3.01處理系統(tǒng)進行方差分析，篩選大豆球蛋白的最佳酶解條件，并對最佳條件進行驗證試驗。

1.3.4 大豆球蛋白水解肽的分子量分布

大豆球蛋白水解肽的分子量測定采用高效液相法[5]。

2 結果與分析

2.1 大豆球蛋白的表征

通過Nagano法分離得到大豆球蛋白，分離效果用SDS-PAGE分析，結果見圖1。

從圖1可以看出，大豆球蛋白中混有少量的β-伴大豆球蛋白。通過AlphaInnotech-AlphaView軟件的光密度掃描分析得出大豆球蛋白含量為86.6%。

圖1 大豆球蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of the glycinin

2.2 大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的單因素試驗

2.2.1 底物濃度對水解的影響

水解條件：酶和底物比8000 U/g，溫度50℃，pH 7.5，水解時間 4 h。以 DH 為指標研究 10、20、30、40、50 g/L的底物濃度對水解的影響，結果見圖2。

圖2 底物濃度對水解度的影響Fig.2 Effects of substrated concentration on DH of hydrolysate

大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白在水溶液中進行，大豆球蛋白可溶解于水，由圖2可以看出，底物濃度對水解度的影響很大，在10 g/L～50 g/L的底物濃度范圍內(nèi)，大豆球蛋白的水解度均隨著底物濃度的增加而顯著下降。雖然10 g/L的底物濃度下水解度最大，但在實際生產(chǎn)主要考慮生產(chǎn)效率，因此選擇20 g/L的蛋白濃度。

2.2.2 酶與底物比對水解的影響

水解條件：底物濃度20g/L，溫度50℃，pH7.5，水解時間 4h。以 DH 為指標研究 4000、6000、8000、10000、12000 U/g的酶與底物比對水解的影響。結果見圖3。在工業(yè)生產(chǎn)中，酶濃度是影響成本的重要因素。由圖3可以看出，在底物濃度一定時，水解度與酶濃度呈正相關，當酶與底物比達到8000 U/g時，大豆球蛋白水解度基本達到最大，繼續(xù)增加酶與底物比水解度也不再增加。因此，可以選擇的酶與底物比對為8000 U/g。

圖3 酶與底物比對水解度的影響Fig.3 Effects of enzyme concentration on DH of hydrolysate

2.2.3 水解時間對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，溫度 50℃，pH 7.5。以 DH為指標研究2、3、4、5、6 h的水解時間對水解的影響。結果見圖4。

圖4 水解時間對水解度的影響Fig.4 Effects of time on DH of hydrolysate

水解時間是影響酶解反應的重要因素，對工業(yè)生產(chǎn)效率也有直接的影響。由圖4可以看出，水解度與酶解時間呈正相關。大豆球蛋白的水解度在4 h左右達到最大值。因此，選擇4 h的水解時間。

2.2.4 pH對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，溫度50℃，水解時間4 h。以DH為指標研究7.0、7.5、8.0、8.5的pH對水解的影響，結果見圖5。

圖5 pH對水解度的影響Fig.5 Effects of pH on DH of hydrolysate

pH是影響酶催化活性的重要因素。由圖5可以看出，大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的最適pH為8.0。

2.2.5 水解溫度對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，pH 7.5，水解時間4 h。以DH為指標研究40、45、50、55、60℃的水解溫度對水解的影響，結果見圖6。

圖6 水解溫度對水解度的影響Fig.6 Effects of temperature on DH of hydrolysate

水解溫度對大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白有雙重影響。一方面溫度增加會降低溶液的黏度，提高蛋白質的分散性，有利于酶與底物的結合，提高水解度；另一方面，過高的溫度會加速酶的變性導致水解度降低。由圖6可以看出，在低溫條件下，蛋白水解度較低，隨著溫度的增加，蛋白水解度逐漸增大，在55℃左右達到最大，繼續(xù)升高溫度會導致蛋白水解度的下降。因此，大豆球蛋白的最適溫度為55℃。

2.3 酶解反應的正交試驗

根據(jù)以上的單因素試驗，初步認定大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白反應的適宜條件為：酶和底物比8000U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時間4h。選取了 20g/L的底物濃度作為試驗濃度。根據(jù)單因素試驗的結果，對酶和底物比、水解時間、溫度和pH 4種因素各取3個水平，進行L9（34）正交試驗，正交試驗的因素、水平設計見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

由極差分析可知，各因素對水解度的影響大小順序為A>D>C>B，即酶和底物比>溫度>pH>水解時間根據(jù)K值大小得到酶解反應條件的優(yōu)組合為A3B2C2D2，即酶和底物比 10000 U/g，溫度 55 ℃，pH8.0，水解時間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 大豆球蛋白水解肽的分子量分布

對大豆球蛋白水解肽進行高效分子排阻色譜分析，洗脫圖譜見圖7，通過GPC軟件計算后分子量分布情況見表3。

圖7 大豆球蛋白水解肽的高效分子排阻色譜分析Fig.7 HPLC(TSKgel G2000swxl,300 mm×7.8 mm)of glycinin peptide.Flow phase:acetonitrile/water/TFA=10/90/0.1(v/v/v);Wavelength:220 nm;Flow rate:0.5 mL/min;Injection volume:20 μL;Temperature:25℃.

由表3可以看出，大豆球蛋白水解肽的分子量主要分布在130 u～1000 u之間，占肽總量的86.5%。其中300 u～1000 u為2個～8個氨基酸殘基的短肽，這部分占肽總量的64.7%；130 u～300 u占21.8%，根據(jù)數(shù)均分子量和重均分子量分析，其主要成分為二肽；還有10%的分子量為1000 u～5000 u的寡肽及少量的氨基酸，小于130 u的部分主要為單氨基酸，由于分子量處在標準曲線之外，所以分子量的數(shù)值偏低。說明了大豆蛋白改性酶對大豆球蛋白的水解充分，水解產(chǎn)物具有良好的均一性，單氨基酸的含量很低，有利于產(chǎn)物的分離純化和性質鑒定，并且對于發(fā)揮大豆肽的功能性具有重要意義。

表3 大豆球蛋白水解肽的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of glycinin peptide peptides

3 結論

采用大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白，結果表明，在20 g/L的蛋白濃度下最佳的酶解條件為酶和底物比10000 U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。高效分子排阻色譜分析表明大豆球蛋白水解肽主要為130 u～1000 u的短肽，占肽總量的86.5%，表現(xiàn)出良好的均一性。大豆球蛋白水解肽的生理功能需要進一步研究。本研究為工業(yè)生產(chǎn)大豆肽提供了理論依據(jù)。

[1]劉春,王紅玲,崔竹梅，等.大豆籽粒貯藏蛋白11S和7S組分提取分離方法的優(yōu)化[J].中國油脂,2006,31(2):31-36

[2]中華人民共和國國家標準.GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[S].北京：中國標準出版社,2009：6-8

[3]中華人民共和國國家標準.GB/T 5009.5-2010食品中蛋白質的測定[S].北京：中國標準出版社,2010:1-4

[4]肖凱軍,高孔榮,曾慶孝.酶解大豆分離蛋白的特性研究[J].廣州食品工業(yè)科技,1995,11(2):5-10

[5]中華人民共和國國家標準.GB/T 22492-2008大豆肽粉[S].北京：中國標準出版社,2008：4-5

Study on Hydrolysis of Glycinin

ZOU Xian-feng1,WU Xiu-li2,CHEN Xing1,GAO Chang-cheng1,*
（1.Key Laboratory of Agricultural Products Processing in Changchun University,Changchun 130022,Jilin，China；2.College of Biological Sci&Tech，Changchun University,Changchun 130022,Jilin，China）

According to Nagano method,glycin in was isolated from soybean cake and was hydrolyzed by soy protein modification enzyme to produce hydrolysate peptide.Optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined by single-factor and orthogonal test.Then the distribution of glycinin hydrolysate peptide was detected by means of HPLC.Results showed that these optimum conditions were followed:10000 U/g of enzyme concentration,55℃,pH 8.0 and 4 h of reaction time when substrate concentration was 20 g/L,and the degree of hydrolysis(DH)was 69.6%in these conditions.Glycinin hydrolysate peptides of 130 u-1000 u occupied 86.5%in total peptides,which showed that the peptide possessed excellent uniformity.

glycinin;glycinin hydrolysate peptide;soy protein modification enzyme

吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目(2008365)；吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目(2009229)；長春市科技計劃項目(08YJ18)

鄒險峰（1971—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品生物技術。

*通信作者

2011-07-29