李夢熹，關(guān)榮發(fā)，*，芮昶，劉光富，趙進，蔣家新

（1.中國計量學院浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018；2.杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江 杭州 310019）

柚子皮中抗過敏活性粗提物提取工藝的研究

李夢熹1，關(guān)榮發(fā)1，*，芮昶2，劉光富1，趙進1，蔣家新1

（1.中國計量學院浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018；2.杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江 杭州 310019）

對柚子皮抗過敏活性成分進行提取，通過單因素試驗研究乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)等提取條件對提取效果的影響，并通過正交試驗優(yōu)化其提取工藝，確定最佳提取條件為：乙醇濃度80%，提取時間45 min，提取溫度為50℃，料液比1∶30（g/mL），提取次數(shù)為2次。在此條件下進行驗證試驗，透明質(zhì)酸酶抑制率達到22.51%。

柚子皮；抗過敏；粗提物；提取

隨著人們生活水平的提高，工業(yè)發(fā)展對環(huán)境的影響使得國內(nèi)外過敏性疾病逐漸增多。據(jù)日本厚生省的過敏研究結(jié)果顯示，22%的成人和35%的幼兒都曾患過不同程度的花粉癥、過敏性皮炎、哮喘、鼻炎等過敏性疾?。欢谖覈?，過敏性疾病的發(fā)病率約為10%，且呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[1]。雖然過敏性疾病不像癌癥和心血管疾病那樣對人體健康造成直接傷害，但由于其具有多發(fā)性和常見性，同時伴隨多種并發(fā)癥等特點，可嚴重地影響居民的生活質(zhì)量、工作和學習。預防和治療過敏性反應主要用具有一定毒副作用的化學合成藥物，但這些藥物在緩解過敏癥狀的同時，也都存在使人困倦、乏力等副作用。因此，研究開發(fā)抗過敏的天然產(chǎn)物，在現(xiàn)代功能性食品和醫(yī)藥保健事業(yè)中受到了越來越多的關(guān)注，從天然植物資源中挖掘高效低毒的抗過敏活性生物活性成分已成為抗過敏研究的熱點之一[2-3]。

柚子在浙江、四川、廣東、福建和湖南等省均有種植，除了我國種植外，東南亞、南美和南非的許多國家也都是柚子的主要產(chǎn)地。由此可知，柚子是國內(nèi)外大眾化的果品之一。浙江省柚子資源豐富，其中35%被用來加工，而柚子皮是柚子加工業(yè)的主要副產(chǎn)物，約占整個果重的25%～40%[4]。因此，如何對柚子皮進行深加工以提高柚子產(chǎn)品附加值在當前提倡循環(huán)經(jīng)濟的背景下顯得更為迫切和重要。至21世紀初，已知柚子皮中含有豐富的酚酸和類黃酮等成分，已鑒定出來的類黃酮化合物就有60余種，以橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素蕓香苷等二氫黃酮類化合物最為常見[5]。研究表明類黃酮物質(zhì)在人和動物體具有抗腫瘤、抗病菌、抗炎、降低毛細血管脆性、抗過敏等多方面的生物學功能，有可能成為新型植物源抗過敏藥物的研究重點[6]。但截止到21世紀初，關(guān)于植物源抗過敏成分的研究較少，分離天然植物中的抗過敏成分將能有效的解決過敏的問題。鑒于此，本試驗從省時、高效、節(jié)能等角度出發(fā)，篩選柚子皮中抗過敏活性粗提物的最佳提取工藝，以期為柚子皮中抗過敏活性物質(zhì)的提取研究提供參考，同時進一步提高柚子的綜合利用價值,有利于食品資源的充分利用和清潔生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮柚子：采自浙江省衢州市；乙醇、氫氧化鈉、DBMA、乙酰丙酮、氯化鈣、碳酸鈉、冰醋酸、無水乙酸鈉，均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；透明質(zhì)酸酶type-Ⅰ、透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀：均購自sigma公司。

KA-1000型離心機：上海安亭科學儀器廠；DHG-9070A型烘箱：杭州藍天化驗儀器廠；UV-2501型紫外可見分光光度計：日本島津公司；FW80型微型高速萬能粉碎機：天津市華鑫儀器；HSS1-B型恒溫水浴槽：成都儀器廠；RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FA2004N型電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 工藝流程

新鮮柚子皮→低溫下烘干（50℃）→粉碎機粉碎→過40目篩（裝袋備用）→考察不同因素對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響→過濾→濾液濃縮→冷凍干燥（粗成分）

1.3 單因素試驗設計

1.3.1 乙醇濃度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

精密稱取3 g柚子皮粉末，分別加40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇30 mL，進行提取，每次提取30 min，濾液濃縮，冷凍干燥，進行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗。

1.3.2 提取時間對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

精密稱取3 g柚子皮粉末，加單因素試驗中最佳濃度的乙醇30 mL，進行提取，每次的提取時間分別控制在15、30、45、60、75 min，濾液濃縮，冷凍干燥，進行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗。

1.3.3 提取溫度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

精密稱取3 g柚子皮粉末，加單因素試驗中最佳濃度的乙醇30 mL，以單因素最佳提取時間進行提取，溫度分別控制在30、40、50、60、70 ℃，濾液濃縮，冷凍干燥，進行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗。

1.3.4 料液比對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

精密稱取3 g柚子皮粉末，加單因素試驗中最佳濃度的乙醇，控制料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），進行提取，時間在單因素最佳提取時間，溫度在單因素最佳溫度，濾液濃縮，冷凍干燥，進行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗。

1.3.5 提取次數(shù)的選擇

精密稱取3 g柚子皮粉末，按單因素最佳條件控制，分別提取1、2、3次，濾液濃縮，冷凍干燥，進行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗。

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，對乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）4個因素進行正交試驗，以確定最佳提取工藝，因素與水平見表1。

表 1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 乙醇濃度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

乙醇濃度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響，見圖1。

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度的增大，粗提物對透明質(zhì)酸酶的抑制率呈增大趨勢，當濃度為80%時，抑制率最高，當乙醇濃度擴大到90%時，抑制率開始減小。因此，本試驗選擇提取時的最佳乙醇濃度為80%。

2.1.2 提取時間對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

提取時間對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響，見圖2。

由圖2可知，當提取時間在15 min～45 min內(nèi)，隨著提取時間的延長，粗提物對透明質(zhì)酸酶抑制率顯著增加。當提取時間達到45 min以后，雖然提取時間的延長能進一步增加抑制率，但是此時抑制率增加變得十分緩慢，同時時間過長，雜質(zhì)成分溶解也隨之增加，給后續(xù)提純精制造成困難。因此，本試驗選擇最佳提取時間為45 min。

2.1.3 提取溫度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

提取溫度對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響，見圖3。

由圖3可以看出，隨著提取溫度的升高，粗提物對透明質(zhì)酸酶的抑制率不斷地增加，當溫度為50℃時抑制率達到最大，當溫度達到60℃時，抑制率呈下降趨勢，因此，本試驗選擇最佳提取溫度為50℃。

2.1.4 料液比對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

料液比對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響，見圖4。

由圖4可知，透明質(zhì)酸酶抑制率隨著料液比的升高而增加，當料液比在1∶30以下時，增幅比較大，料液比超過1∶30以后，增幅比較小，曲線變得較為平緩，而且溶劑太多會給后序的濃縮帶來困難，因此料液比以1∶30為宜。

2.1.5 提取次數(shù)對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響

提取次數(shù)對柚子皮中抗過敏活性粗提物提取效果的影響，見圖5。

由圖5可以看出，提取次數(shù)由1次增加到3次的過程中，透明質(zhì)酸酶抑制率逐漸增加，但第3次時抑制率的增加不是很明顯。次數(shù)過多不僅增加了提取時間，而且給濃縮和精制工作帶來很大的不便，因此從工業(yè)化角度來說，本試驗選擇最佳提取次數(shù)為2次。

2.2 正交試驗分析

由于柚子皮中抗過敏粗提物受到乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比4個因素的交叉影響，通過單因素試驗，分析了各因素對抑制率的影響，確定了較佳的單因素試驗條件范圍，在此基礎上，為了全面分析這4個因素的影響，本研究設計了四因素三水平的正交試驗，以乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比為考察因素，以柚子皮中抗過敏粗提物的透明質(zhì)酸酶抑制率為考察指標，選用L9（34）正交表對柚子皮中抗過敏粗提物提取工藝進行研究。正交試驗結(jié)果極差分析結(jié)果見表2。

表 2 正交試驗結(jié)果分析表Table 2 Result of orthogonal test

表2結(jié)果表明，各因素對抗過敏粗提物的透明質(zhì)酸抑制率影響程度為：提取溫度>乙醇濃度>提取時間>料液比，說明提取溫度的高低對抗過敏粗提物的提取影響最大。對以上試驗結(jié)果進行分析，可知柚子皮中抗過敏活性粗提物的最佳提取條件為：乙醇濃度為80%，提取時間為45 min，提取溫度為50℃，料液比1∶30（g/mL）。

3 結(jié)論

本試驗對柚子皮中的抗過敏物質(zhì)進行了提取工藝的研究，通過單因素試驗研究了乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比對提取效果的影響，并通過正交試驗確定了影響因素的主次順序。通過試驗確定了柚子皮中抗過敏活性粗提物的最佳提取工藝：乙醇濃度為80%，提取時間為45 min，提取溫度為50℃，料液比1∶30（g/mL），提取次數(shù)為2次，在此條件下進行3次平行試驗，平均透明質(zhì)酸酶抑制率可達22.51%。該提取工藝提取效率高、操作簡單、對環(huán)境友好，能有效、快速的提取柚子皮中的抗過敏活性成分，有利于進一步詳細研究柚子皮中抗過敏活性成分，有利于提供一種天然的抗過敏功能性成分，有利于食品加工副產(chǎn)物的綜合利用。

[1]Larry G Ailian.Arthoropod allergens and human health[J].Annual review of entomology,2002,47(2):39-43

[2]丁曉雯.柑桔皮提取液抗氧化及其它保健功能研究[D].成都:西南農(nóng)業(yè)大學博士學位論文,2004:28

[3]Chen K H,Weng M S,Lin J K.Tangeretin suppresses IL-1betainduced cyclooxygenase（COX）－2 expression through inhibition of p38 MAPK,JNK,and AKT activation in human lung carcinoma cells[J].Biochemical pharmacology,2007,73(2):215-227

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[5]Green C O,Wheatley A O,Osagie A U,et al.Determination of polymethoxylated flavones in peels of selected Jamaican and Mexican citrus（Citrus spp.）cultivars by high－performance liquid chromatography[J].Biomedical chromatography,2007,21(1):48-54

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Research on the Extraction Technology of Crude Anti-allergic Component in Grapefruit Peel

LI Meng-xi1，GUAN Rong－fa1，*，RUI Chang2，LIU Guang－fu1，ZHAO Jin1，JIANG Jia－xin1
（1.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection ＆ Quarantine，China Jiliang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；2.Hangzhou Test Institute of Quality，Hangzhou 310019，Zhejiang，China）

Extracte the crude anti－allergic component in grapefruit peel.Different extraction conditions：ethanol concentration，extraction time，reaction temperature，solid －liquid ratio and extraction times were studied through single factor experiment.To optimize the extraction technology，orthogonal test was used.The best conditions were as follows：ethanol concentration was 80%，extraction time was 45 min，temperature was 50 ℃，solid－liquid ratio was 1∶30 （g/mL），and extraction times were two.Under the optimal extraction technology，the hyaluronidase inhibition rate was 22.51%.

grapefruit peel；anti－allergic；crude extract；extract

浙江省科技廳分析測試科技計劃（2007F70027）；浙江省新苗人才計劃項目(2008R40G2080020)；杭州市科技計劃項目（20091832B50）；中國計量學院校重點建設課程項目資助

李夢熹（1989—），女（漢），本科在讀，主要從事抗過敏活性物質(zhì)提取的研究。

*通信作者：關(guān)榮發(fā)，男，副教授，碩士生導師，研究方向：食品加工與安全。

2011-08-11