周可，吳黎莉，陳沄

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京210042）

異維A酸（Isotretinoin）是第一代維甲酸類藥， 目前為治療中重度痤瘡最有效的藥物之一。自1982年經(jīng)FDA認(rèn)證在美國上市以來已有近30年臨床使用歷史[1]。多年的臨床治療發(fā)現(xiàn)，部分病人療效不盡如人意，而且與病情的輕重程度無關(guān)；另外，異維A酸人體藥代動力學(xué)（藥動學(xué)）研究發(fā)現(xiàn)其藥動學(xué)參數(shù)有較大的個體差異[2]。筆者試圖對部分人群多藥耐藥基因（MDR1）遺傳多態(tài)性角度進行分析，從一個方面探尋影響人體內(nèi)異維A酸代謝動力學(xué)過程進而影響療效的原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象 試驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院國家藥品臨床試驗機構(gòu)倫理委員會同意后實施。21例男性健康受試者，年齡20～30歲，身高161～185 cm，體質(zhì)量53～75 kg。受試者無藥物過敏史，常規(guī)體檢及實驗室檢驗結(jié)果證明肝腎功能正常、心電圖正常、精神狀態(tài)良好。受試前2周及試驗期間未服用其他藥物。受試前對試驗?zāi)康呐c要求完全了解，并志愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 材料與儀器 異維A酸膠丸（泰爾絲，10 mg/粒，上海延安萬象藥業(yè)股份有限公司）；異維A酸對照品（批號20080917，純度100%，重慶華邦制藥股份有限公司）；阿維A（批號AC-0712004-711，純度100.2%，漢江藥廠五分廠）。人血基因組DNA抽提試劑盒、GoTaq DNA聚合酶。CYR2 B6等位基因體外擴增引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。乙腈（色譜純，德國Merck公司），正己烷（色譜純，美國Burdick&Jackson公司），異丙醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）。

LC/MS-2010EV液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；2-16K低溫高速離心機（德國Sigma公司）；Hema480PCR擴增儀（海南黑馬公司）；Bio-rad PowerPac Basic電泳儀（美國 Bio-rad公司）；JS-380A自動凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司）。

1.2.2 給藥方式及血樣采集 入選受試者空腹10 h后，采取0時靜脈空白血樣3 mL，將40 mg受試藥物用 250 mL溫水送服。給藥后 0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、60 h 靜脈采血 3 mL，血樣肝素抗凝，3 000 r/min離心5 min，分離血漿。血漿及血細(xì)胞分別置-20℃儲存。試驗過程完全避自然光。

1.2.3 血漿藥物濃度測定 精密吸取血漿0.5 mL，精密加入阿維 A 溶液 25 μL（10 μg/mL），正己烷∶異丙醇（95∶5）4.0 mL，渦旋混勻 3 min，3 500 r/min 離心10 min，取盡上清液，置37℃水浴氮氣吹干。殘留物以100 μL HPLC-MS測定用流動相渦旋30 s溶解，高速離心后，上清液供LC-MS分析。

色譜條件：色譜柱：SHIMADZU Shim-pack VPODS C18（150×2.0 mm ID,5 μm）；流動相：乙腈∶水=90∶10；流速：0.2 mL/min；ESI-MS 選擇性負(fù)離子檢測，異維A酸測定離子[M-H]-m/z299.05；內(nèi)標(biāo)阿維A測定離子[M-H]-m/z 325.00。主要ESI-MSD工作參數(shù)：CDL溫度250℃；Block溫度200℃；Probe電壓+4.5 kV；檢測電壓1.45 kV；霧化氣流速1.5 L/min。

1.2.4 提取DNA 取血細(xì)胞2 mL，用人血細(xì)胞DNA提取試劑盒提取基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA的抽提效果，紫外分光光度計檢測其含量。

1.2.5 等位基因體外擴增 采用等位基因特異擴增法（allele-specific amplification，ASA-PCR）對 MDR1 exon12（C1236T）、exon21（G2677T/A）、exon26（C3435T）位點進行基因分型檢測。參照文獻[3-4]的方法，采用文獻報道的已知引物，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫（http://ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST分析比對，其特異性較好[5-6]。引物序列及擴增長度見表1。擴增反應(yīng)分兩次進行。針對不同的待測基因位點，按表1選用相應(yīng)的引物進行第一次擴增，獲得含待測基因位點的DNA片段。首次擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為DNA模板，再按表1選用相應(yīng)的引物進行ASA-PCR擴增，分別獲得含不同突變堿基的產(chǎn)物。第一次擴增反應(yīng)：反應(yīng)體系：GoTaq Green Master Mix 12.5 μL，DNA 樣品 5 μL（約 100 ng），相應(yīng)引物 1 對各 1 μL，無菌雙蒸水 5.5 μL，總體積 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，按照表2選擇相應(yīng)的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，共35～40個循環(huán)；72℃延伸7 min。4℃冷藏保存。第二次擴增反應(yīng)：反應(yīng)體系：GoTaq Green Master Mix 12.5 μL，首次擴增產(chǎn)物的稀釋液5 μL，相應(yīng)引物1對各1 μL，無菌雙蒸水5.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，再按表2選擇相應(yīng)的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，共35～40個循環(huán)；72℃延伸7 min。4℃冷藏保存。

表1 MDR1引物序列

表2 MDR1基因各外顯子PCR反應(yīng)的引物及退火溫度

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 血藥濃度數(shù)據(jù)采用中國藥科大學(xué)藥代中心編寫的BAPP2.2軟件處理，求算出每個受試者的藥動學(xué)參數(shù)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用 Kruskal-Wallis秩和檢驗（SPSS15.0軟件包）比較分析不同基因型組之間異維A酸人體動力學(xué)參數(shù)的差別。

2 結(jié)果

2.1 異維A酸人體藥代動力學(xué)參數(shù) 21例受試者單次口服40 mg異維A酸膠丸后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)包括血藥峰濃度（Cmax）、血藥濃度達(dá)峰時間（Tmax）、消除半衰期（T1/2）、平均滯留時間（MRT）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）,見表3。經(jīng)體質(zhì)量校正使血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)化，以排除受試者體質(zhì)量對血藥濃度的影響。

2.2 MDR1基因的擴增結(jié)果

2.2.1 MDR1 exon12（C1236T）ASA-PCR擴增結(jié)果 MDR1 C1236T首次擴增產(chǎn)物片段為336 bp，第二次選用引物P6-P12或P6-P13的擴增產(chǎn)物均為223 bp。P12為0、P13為223 bp的樣本為CC型（野生型），P12、P13均為223 bp的樣本為CT型（雜合型），P12為223、P13為0的樣本為TT型（突變型）。首次擴增結(jié)果見圖1，ASA-PCR擴增結(jié)果見圖2。

表3 21例受試者單次口服40 mg異維A酸膠丸后異維A酸的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

2.2.2 MDR1 exon21（G2677T/A）ASA-PCR擴增結(jié)果 MDR1 G2677T/A首次擴增產(chǎn)物片段為225 bp，第二次擴增選用引物P3-P9、P3-P10、P3-P11的擴增產(chǎn)物均為163 bp。根據(jù)ASA-PCR擴增的結(jié)果，按表4可將此位點分為6種基因型。首次擴增結(jié)果見圖3，ASA-PCR擴增結(jié)果見圖4。

表4 基因型的分型確定

2.2.3 MDR1 exon26（C3435T）ASA-PCR擴增結(jié)果MDR1 C3435T首次擴增產(chǎn)物片段為248 bp，第二次選用引物P1-P7或P1-P8的擴增產(chǎn)物均為210 bp。P7為0、P8為210 bp的樣本為CC型（野生型），P7、P8均為210 bp的樣本為CT型（雜合型），P7為210、P8為0的樣本為TT型（突變型）。首次擴增結(jié)果見圖5，ASA-PCR擴增結(jié)果見圖6。

表5 MDR1exon12（C1236T）基因多態(tài)性分布情況

2.3 MDR1等位基因多態(tài)性分布情況 21例受試者的測定結(jié)果見表 5～7，MDR1exon12（C1236T）CC型11例（52.4%），CT型 7例（33.3%），TT型 3例（14.3%）。MDR1exon21（G2677T/A）GG 型 0例（0%），GT型1例（4.8%），TT型7例（33.3%），GA型4例（19.0%），AT型 7例（33.3%），AA 型 2例（9.5%）。MDR1exon26（C3435T） 中 CC 型 1例（4.8%），CT型14例（67.0%），TT型6例（28.6%）。

表6 MDR1exon21（G2677T/A）基因多態(tài)性分布情況

表7 MDR1exon26（C3435T）基因多態(tài)性分布情況

2.4 藥動學(xué)參數(shù)與基因型關(guān)系分析 MDR1exon12（C1236T）的CC型歸為野生型組，CT型（雜合型）與TT型（突變純合型）合并為突變型組；受試人群未發(fā)現(xiàn)MDR1exon21（G2677T/A）GG型即野生型的存在，因此將GT型（雜合型）、GA型（雜合型）歸為雜合型組，AT型（突變雜合型）、TT型（突變純合型）、AA型（突變純合型）歸為突變型組；MDR1exon26（C3435T）的CC型在受試人群中僅檢出1例，因此將CC型與CT型（雜合型）歸為雜合型組，TT型（突變純合型）為突變型組。

21例受試者的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)分別根據(jù)上述每一基因位點的基因型分組，分別進行比較分析。見表8。結(jié)果表明MDR1exon12（C1236T）的不同基因型異維A酸的體內(nèi)某些藥動學(xué)參數(shù)有差異。與野生型組相比，變異型組Cmax、Tmax有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為 0.057、0.252）；AUC0～60顯著提高（P=0.049）、T1/2及MRT明顯縮短（P 值分別為 0.011、0.035）。

表8 MDR1等位基因多態(tài)性與異維A酸藥動學(xué)參數(shù)的關(guān)系

MDR1exon21（G2677T/A）的不同基因型異維A酸的體內(nèi)各項藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MDR1 exon26（C3435T）參數(shù) T1/2、MRT 、AUC0～60在雜合型組與變異型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，變異型組Cmax有所增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；變異型組Tmax顯著小于雜合型組（P=0.03）。

3 討論

P-gp是多藥耐藥基因（multidrug resistance 1,MDR1）的產(chǎn)物，屬ATP結(jié)合家族。P-gp可能量依賴性地將作用底物由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜外，具有跨膜滲透泵的作用。P-gp在小腸上皮細(xì)胞、膽汁的微管細(xì)胞、脈絡(luò)叢、淋巴細(xì)胞近曲小管表面的腎細(xì)胞等許多組織有表達(dá)，故對脂溶性藥物的腸道吸收、藥物及（或）代謝物經(jīng)腎、膽汁、腸道的排泄過程均有參與。近年多項研究證實遺傳因素在個體間P-gp表達(dá)和功能的差異中扮演了重要角色[7]。MDR1基因位于人染色體7q21.1～21.12，基因全長約209kb，由28個外顯子編碼1280個氨基酸，分子質(zhì)量為170ku。已發(fā)現(xiàn)的 48個 SNPs中，外顯子 21、26、12的G2677T/A、C3435T、C1236T的單核苷酸多態(tài)性具有重要的功能意義，他們間的連鎖程度在不同種族間差異很大，具有連鎖不平衡性。上述3個MDR1的基因位點在中國人群發(fā)生突變的頻率較高，分別為50%（G2677T）、12.5%（G2677A）、53.1%（C3435T）、71.9%（C1236T）。MDR1的多態(tài)性直接影響P-gp的表達(dá)和功能，MDR1的兩個等位基因中只要有一個的DNA鏈發(fā)生突變，就會使基因產(chǎn)物P-gp的細(xì)胞表達(dá)和功能明顯下降；若兩條DNA鏈均發(fā)生突變，P-gp的表達(dá)和功能會繼續(xù)下降，但下降幅度明顯減小[3-4，8]。

有關(guān)MDR1基因多態(tài)性與異維A酸人體藥代動力學(xué)過程的關(guān)系研究未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)MDR1 C1236T基因多態(tài)性在21名受試者中有呈現(xiàn)，即 CC型 11例（52.4%）、CT型 7例（33.3%）、TT型3例（14.3%）。由于變異型（TT型）樣本僅為3例，而一或兩條DNA鏈發(fā)生突變，均可使產(chǎn)物蛋白表達(dá)及功能的改變，從而影響異維A酸的體內(nèi)過程，故將CT及TT型歸為一組（稱為變異型組）與CC型（野生型）進行比較分析。分析結(jié)果表明變異型組Cmax、Tmax均明顯提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；變異型組的AUC0～60顯著增加，提示變異型組P-gp的表達(dá)及功能可能下降，以上結(jié)果與文獻報道的等位基因突變導(dǎo)致其功能改變的趨勢相符合。21例受試者未發(fā)現(xiàn)有MDR1 G2677T/A的野生型（GG型）存在，MDR1 C3435T的野生型（CC型）也僅檢出1例，這兩個位點進行雜合型組與變異型組的比較分析表明：除Tmax（P值為0.03）外，其他藥動學(xué)參數(shù)在這兩個基因位點的不同基因型組之間無明顯差異。這一結(jié)果與上述分析相符。

人體內(nèi)藥物代謝過程有多種酶共同參與，彼此之間的關(guān)系及（或）可能存在代償機制，加之參與藥物吸收的P-糖蛋白、藥物靶細(xì)胞表面受體表位基因突變等也可影響藥物體內(nèi)過程[9]。本次試驗研究對更深入地探討異維A酸臨床適應(yīng)證療效差異以及異維A酸藥物基因組學(xué)研究有一定意義。

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