李楠

（天津渤海職業(yè)技術學院，天津 300402）

黑花生衣色素中花色苷類色素含量豐富。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷類色素具有抗氧化、清除自由基等作用。自由基學說認為，自由基是引起機體衰老的根本原因，消除體內多余自由基具有延長壽命的功效。本文以黑花生衣色素(BPSP)為原料,研究了該色素對自由基的清除作用,為該色素在食品中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黑花生：市售；DPPH：日本東京化成工業(yè)株式會社；T ris-HCl緩沖液,鄰苯三酚,檸檬酸、FeSO4-EDTA、蔗糖酯、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、α-脫氧核糖、磷酸二氫鈉、鹽酸、VC等試劑均為分析純。

1.2 儀器

Vv-7504紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；FA－2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；精密數顯酸度計：上海天達儀器有限公司；UV-1249紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HP20大孔樹脂：天津南開大學化工廠。

1.3 方法

1.3.1 黑花生衣色素提取方法

將黑花生衣置于燒杯中，加入pH=1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液進行浸提，其中料液比（g/mL）為1∶50，放入80℃恒溫水浴中浸提2 h，浸提級數為2級[1]；取濾液,再經HP20樹脂吸附、80%乙醇洗脫旋轉蒸發(fā)得到BPSP濃縮膏待用[2]。

1.3.2 黑花生衣色素抗氧化能力的測定

1.3.2.1 清除羥自由基能力的測定[3]

分別取 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL 6 個不同濃度的待測液各0.2 mL，依次加入10 mmol/L FeSO4-EDTA混合液0.2 mL、10 mmol/L的α-脫氧核糖溶液0.2 mL，而后用磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4，0.1 mol/L）定容至1.8 mL，再加入10 mmol/L H2O20.2 mL和1 mL的濃度為5%蔗糖酯，混勻后置于25℃恒溫水浴中反應1 h后，加入1 mL三氯乙酸（TCA，2.8%）溶液，和 1 mL硫代巴比妥酸溶液(TBA，1.0%)，混勻后置于沸水浴中反應15 min，冷卻后以PBS為參比于520 nm處比色測定吸光值為A。同時做空白試驗,所測吸光值為A0。以VC為陽性對照進行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

1.3.2.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定[4]

取 2.7 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L、pH 8.2），加入蒸餾水0.1 mL，于25℃恒溫水浴10 min后，加入0.2 mL鄰苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A1。分別取濃度為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待測液各 0.1 mL，加入2.7 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L、pH 8.2），于 25 ℃恒溫水浴10 min，加入25℃預熱的10 mmol/L HCl溶液0.2 mL，迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A2。取濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待測液各0.1mL，加入2.7mLTris-HCl緩沖液（0.05mol/L、pH 8.2），于25℃恒溫水浴10 min后,加入0.2 mL鄰苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A3。以VC為陽性對照進行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

1.3.2.3 清除自由基效能力的測定——DPPH法[5]

將提取液配制成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL 7個濃度，分別吸取樣液2.0 mL，加入濃度為2.0 mg/mL DPPH·乙醇溶液2.0 mL，搖勻、于25℃水浴30 min，以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A1。同時，為扣除試劑本身顏色的影響，取2.0 mL待測樣液與2.0 mL 95%乙醇進行混合，以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A2。2.0 mL將DPPH·乙醇溶液與2.0 mL 95%乙醇混合，同樣以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A3。每組測定3次，求取平均值，按下述公式計算樣品的抑制率。以VC為陽性對照進行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

2 結果與討論

2.1 黑花生衣色素清除羥自由基的效果

黑花生衣色素和VC對羥自由基的清除效果見圖1。

圖1 黑花生衣色素和VC對羥自由基清除率對比Fig.1 Comparison BPSP and VCon the elimination of·OH

由圖1可以看出，同等濃度下VC對于羥自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于羥自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強。當黑花生衣色素和VC濃度超過0.1mg/mL時，清除率增加速度明顯減緩，濃度增加對清除效果影響不大。

2.2 黑花生衣色素清除超氧陰離子自由基的效果

黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基的清除效果見圖2。

圖2 黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基清除率對比Fig.2 Comparison BPSP and VCon the elimination of·O2-

由圖2可以看出，同等濃度下VC對超氧陰離子自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于超氧陰離子自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強。當黑花生衣色素和VC濃度超過0.1 mg/mL時，濃度增加對自由基清除效果影響不大。

2.3 黑花生衣色素清除DPPH自由基的效果

黑花生衣色素和VC對DPPH自由基的清除效果見圖3。

圖3 黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基清除率對比Fig3 Comparison BPSP and VCon the elimination of DPPH·

由圖3可見，同等濃度下VC對DPPH自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于DPPH自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強。當黑花生衣色素和VC濃度超過0.6 mg/ml時，清除率基本不再上升，說明濃度超過0.6 mg/ml后濃度增加對自由基清除效果影響不大。

3 結論

不同抗氧化體系所測的結果往往存在一定的差異，因此,本次實驗采用三種抗氧化體系對黑花生衣色素的抗氧化活性進行評價。實驗表明,黑花生衣色素對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2－）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）均具有良好的清除效果。說明黑花生衣色素是一種具有抗氧化活性的天然植物色素，不僅可用于食品的著色，而且可以起到抗衰老、防癌、抗癌等良好的保健作用。

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