李楠

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

黑花生衣色素中花色苷類色素含量豐富。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷類色素具有抗氧化、清除自由基等作用。自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基是引起機(jī)體衰老的根本原因，消除體內(nèi)多余自由基具有延長壽命的功效。本文以黑花生衣色素(BPSP)為原料,研究了該色素對自由基的清除作用,為該色素在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑花生：市售；DPPH：日本東京化成工業(yè)株式會社；T ris-HCl緩沖液,鄰苯三酚,檸檬酸、FeSO4-EDTA、蔗糖酯、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、α-脫氧核糖、磷酸二氫鈉、鹽酸、VC等試劑均為分析純。

1.2 儀器

Vv-7504紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；FA－2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；精密數(shù)顯酸度計：上海天達(dá)儀器有限公司；UV-1249紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HP20大孔樹脂：天津南開大學(xué)化工廠。

1.3 方法

1.3.1 黑花生衣色素提取方法

將黑花生衣置于燒杯中，加入pH=1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液進(jìn)行浸提，其中料液比（g/mL）為1∶50，放入80℃恒溫水浴中浸提2 h，浸提級數(shù)為2級[1]；取濾液,再經(jīng)HP20樹脂吸附、80%乙醇洗脫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到BPSP濃縮膏待用[2]。

1.3.2 黑花生衣色素抗氧化能力的測定

1.3.2.1 清除羥自由基能力的測定[3]

分別取 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL 6 個不同濃度的待測液各0.2 mL，依次加入10 mmol/L FeSO4-EDTA混合液0.2 mL、10 mmol/L的α-脫氧核糖溶液0.2 mL，而后用磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4，0.1 mol/L）定容至1.8 mL，再加入10 mmol/L H2O20.2 mL和1 mL的濃度為5%蔗糖酯，混勻后置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h后，加入1 mL三氯乙酸（TCA，2.8%）溶液，和 1 mL硫代巴比妥酸溶液(TBA，1.0%)，混勻后置于沸水浴中反應(yīng)15 min，冷卻后以PBS為參比于520 nm處比色測定吸光值為A。同時做空白試驗,所測吸光值為A0。以VC為陽性對照進(jìn)行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

1.3.2.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定[4]

取 2.7 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L、pH 8.2），加入蒸餾水0.1 mL，于25℃恒溫水浴10 min后，加入0.2 mL鄰苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A1。分別取濃度為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待測液各 0.1 mL，加入2.7 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L、pH 8.2），于 25 ℃恒溫水浴10 min，加入25℃預(yù)熱的10 mmol/L HCl溶液0.2 mL，迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A2。取濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待測液各0.1mL，加入2.7mLTris-HCl緩沖液（0.05mol/L、pH 8.2），于25℃恒溫水浴10 min后,加入0.2 mL鄰苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混勻，在520 nm處測定溶液的吸光度A3。以VC為陽性對照進(jìn)行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

1.3.2.3 清除自由基效能力的測定——DPPH法[5]

將提取液配制成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL 7個濃度，分別吸取樣液2.0 mL，加入濃度為2.0 mg/mL DPPH·乙醇溶液2.0 mL，搖勻、于25℃水浴30 min，以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A1。同時，為扣除試劑本身顏色的影響，取2.0 mL待測樣液與2.0 mL 95%乙醇進(jìn)行混合，以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A2。2.0 mL將DPPH·乙醇溶液與2.0 mL 95%乙醇混合，同樣以95%乙醇為對照，在520 nm處測定試液的吸光度A3。每組測定3次，求取平均值，按下述公式計算樣品的抑制率。以VC為陽性對照進(jìn)行試驗。按下式計算清除能力，并繪制清除率與樣品濃度曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑花生衣色素清除羥自由基的效果

黑花生衣色素和VC對羥自由基的清除效果見圖1。

圖1 黑花生衣色素和VC對羥自由基清除率對比Fig.1 Comparison BPSP and VCon the elimination of·OH

由圖1可以看出，同等濃度下VC對于羥自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于羥自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)黑花生衣色素和VC濃度超過0.1mg/mL時，清除率增加速度明顯減緩，濃度增加對清除效果影響不大。

2.2 黑花生衣色素清除超氧陰離子自由基的效果

黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基的清除效果見圖2。

圖2 黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基清除率對比Fig.2 Comparison BPSP and VCon the elimination of·O2-

由圖2可以看出，同等濃度下VC對超氧陰離子自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于超氧陰離子自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)黑花生衣色素和VC濃度超過0.1 mg/mL時，濃度增加對自由基清除效果影響不大。

2.3 黑花生衣色素清除DPPH自由基的效果

黑花生衣色素和VC對DPPH自由基的清除效果見圖3。

圖3 黑花生衣色素和VC對超氧陰離子自由基清除率對比Fig3 Comparison BPSP and VCon the elimination of DPPH·

由圖3可見，同等濃度下VC對DPPH自由基的清除效果優(yōu)于黑花生衣。黑花生衣色素和VC對于DPPH自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)黑花生衣色素和VC濃度超過0.6 mg/ml時，清除率基本不再上升，說明濃度超過0.6 mg/ml后濃度增加對自由基清除效果影響不大。

3 結(jié)論

不同抗氧化體系所測的結(jié)果往往存在一定的差異，因此,本次實驗采用三種抗氧化體系對黑花生衣色素的抗氧化活性進(jìn)行評價。實驗表明,黑花生衣色素對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2－）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）均具有良好的清除效果。說明黑花生衣色素是一種具有抗氧化活性的天然植物色素，不僅可用于食品的著色，而且可以起到抗衰老、防癌、抗癌等良好的保健作用。

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