朱會(huì)霞

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000）

灰樹花是食、藥兼用覃菌，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱非褶菌目多孔菌科樹花菌屬。具有松覃芳香，肉質(zhì)柔嫩，味如雞絲，脆似玉蘭，是極其珍貴的高檔食用覃菌。其具有突出的醫(yī)療保健功能。由于富含鐵、銅和VC，能預(yù)防貧血、壞血病、白癱風(fēng)[1-2]，防止動(dòng)脈硬化和腦血栓的發(fā)生；還具有抑制高血壓和肥胖癥之功效[3]；大量的藥理藥效的研究證明，灰樹花多糖具有顯著的抗腫瘤[4-5]、降血糖、抗肝炎、抗HIV病毒以及改善免疫系統(tǒng)功能等功效。

灰樹花培養(yǎng)過程中，深層發(fā)酵法具有周期短、成本低、產(chǎn)量大等特點(diǎn)。利用深層發(fā)酵法研究灰樹花菌絲體及多糖是研究的熱點(diǎn)之一?；覙浠òl(fā)酵研究過程中，對(duì)灰樹花多糖、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究較少，本文以灰樹花真菌為研究材料，對(duì)其發(fā)酵過程及其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，通過對(duì)其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，以期掌握灰樹花發(fā)酵規(guī)律，為灰樹花擴(kuò)大培養(yǎng)以及工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

灰樹花菌種：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 儀器

食用菌發(fā)酵罐（50 L）：江蘇省鎮(zhèn)江日泰生物工程設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器（CHA-S，往復(fù)）：金壇市天境實(shí)驗(yàn)儀器廠；高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50SII）：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作及培養(yǎng)

1.2.1.1 母種培養(yǎng)基及培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：（PDA培養(yǎng)基）其配方為20%的土豆，2%葡萄糖，2%的瓊脂，pH自然。從母種試管中切取蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面中央28℃恒溫培養(yǎng)10 d。

1.2.1.2 種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%）：馬鈴薯20，葡萄糖2，蛋白胨0.2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.1，pH自然。

種子培養(yǎng)：斜面菌種經(jīng)平板活化后，切成菌塊，接入裝有75 mL種子液的300 mL三角瓶中，于28℃，轉(zhuǎn)速為140 rpm的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)，待菌絲旺盛生長并形成較多菌絲球后，轉(zhuǎn)接入新的種子液中繼代培養(yǎng)。

1.2.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)液體量分?jǐn)?shù)，%）：玉米漿10，葡萄糖 2，蛋白胨 0.3，酵母膏 0.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，pH 自然。

搖瓶培養(yǎng)方法：將種子液按一定的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，特定轉(zhuǎn)速及裝液量條件下，28℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)10 d。

1.2.2 多糖測定

采用苯酚—硫酸法。

1.2.3 生物量菌體干重的測定

取一定量的發(fā)酵液，用已烘干并稱重的濾紙過濾，用水沖洗至洗液不再帶有發(fā)酵液顏色為止。80℃恒溫烘箱中烘至恒重，干燥器中冷卻至常溫，稱重。3500 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用蒸餾水洗滌至無發(fā)酵液顏色，60℃烘干至恒重，稱重。

2 動(dòng)力學(xué)模型[6]

本研究采用Weiss等[7]所用的Logistic方程和Luedeking-Piret方程來描述灰樹花真菌多糖發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)過程。菌體生長描述采用Logistic方程：

式中：xm為最大菌體濃度，比生長速度設(shè)為常數(shù)μ，

該方程的積分式為：

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以ln[x/（xm-x）]對(duì)t作圖得的直線斜率即為μ，截距為：ln（x0/（xm-x0）產(chǎn)物（多糖p）的形成和底物（葡萄糖s）消耗采用Luedeking-Piret方程：

t=0時(shí) p=p0，方程中 m1、m2為模型參數(shù)，依發(fā)酵條件的變化而不同。把方程（1）代入方程（3）得：

穩(wěn)態(tài)時(shí)，dx/dt=0 x=xm

則由方程（3）得：

方程（5）可寫成如下形式：

其中 μ、xm、x0、m1均已知。因此以[p（t）-p0-m1B（t）]對(duì)A（t）作圖，直線斜率即為m2值。發(fā)酵過程中的底物消耗主要與菌體生長和產(chǎn)物合成及其代謝有關(guān)，因此，底物消耗速度可由下式表示：

式中：b1=m1/Yp/s+Ke、b2=1/Yx/s+m2/Yp/s，依上述同一原理當(dāng)菌體生長處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，即dx/dt=0，可利用（10A）式求得b1=-[（ds/dt）/x]穩(wěn)定，進(jìn)而對(duì)（10A）式積分得：

依同樣原理，即以[S0-S（t）-b1B（T）]對(duì) A（t）作圖，所得直線斜率為b2。

式中：b1為動(dòng)力學(xué)參數(shù)，[g/（g·h）]；m2為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，（g/g）；xm為最大菌體濃度，（g/L）；m1為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，g/（g·h）；p0為初始多糖濃度，（g/L）；b2為動(dòng)力學(xué)參數(shù)，（g/g）；p 為多糖濃度，（g/L）；s為底物濃度，（g/L）；x為菌體濃度，（g/L）；pm為最大多糖濃度，（g/L）；t為時(shí)間，d；μ 為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，（1/h）；s0為初始底物濃度，（g/L）；x0為初始菌體濃度，（g/L）。

3 結(jié)果與討論

3.1 灰樹花真菌發(fā)酵過程中菌體及多糖代謝變化

灰樹花真菌7 L發(fā)酵罐培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量200 L/h，接種量10%，28℃培養(yǎng)10 d發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

圖1 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)灰樹花真菌過程曲線Fig.1 The fermentation process of curve for Grifola frondosa fungal in 7Lfermentor

灰樹花真菌發(fā)酵過程中，還原糖前、中期迅速被利用，菌體量達(dá)到最高后，還原糖開始緩慢下降。菌體達(dá)到最大量時(shí)還原糖消耗速率分別為0.27 g/L·h。此刻還原糖降至10%以下。總糖變化趨勢與還原糖基本相似。這與菌體生長、多糖生成利用糖有關(guān)。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，多糖逐漸生成，并且多糖的形成與菌絲體呈一定正相關(guān)性。菌絲體干重最大值22.35 g/L，多糖最大量為1.40 g/L，菌體及多糖產(chǎn)量達(dá)到最大時(shí)間為9 d。

發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的黏度隨發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增大，這與發(fā)酵過程中，菌體量、多糖產(chǎn)量不斷增加有關(guān)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液黏度達(dá)到5.1 Pa·s。

3.2 灰樹花真菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征

3.2.1 灰樹花真菌菌體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

根據(jù)發(fā)酵過程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)xm=22.35（g/L）和動(dòng)力學(xué)模型方程（2A），以ln[x/（xm-x）]對(duì)t作圖得直線斜率，即模型參數(shù)：μ=0.66，x0=1.62（g/L）。將模型參數(shù)代入方程（2B）求得發(fā)酵過程菌體生長的動(dòng)力學(xué)模型如下：

根據(jù)設(shè)定發(fā)酵條件進(jìn)行灰樹花發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)量與模擬計(jì)算如圖2、表1所示。

圖2 灰樹花真菌發(fā)酵菌體生長動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合曲線Fig.2 The fitting curve for frondosa fungal fermentation cell growth kinetics model and the experimental data

表1 灰樹花真菌發(fā)酵菌體生長動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算值、測定值對(duì)比表Table 1 The contrast of Grifola frondosa fermentation dynamic model and deter mination data

如圖2、表1所示，灰樹花真菌發(fā)酵中，菌體生長動(dòng)力學(xué)模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好，將模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行比較，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算得到的菌體量與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行比較，相差不大，最大相對(duì)誤差為4.96%，平均相對(duì)誤差為2.4%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)力學(xué)模型值基本相符。菌體生長動(dòng)力學(xué)模型能很好的表達(dá)灰樹花真菌7 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)菌體的生長過程。

3.2.2 多糖生成動(dòng)力學(xué)

依據(jù)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)μ=0.66，x0=1.62和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)xm=22.35，p0=0.02（g/L）及動(dòng)力學(xué)模型方程（5），計(jì)算得到 m1=0.0068（g/g/d）。以[p-p0-m1B（t）]對(duì) A（t）作圖得發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)m2=0.033（g/g）。將模型參數(shù)代入方程（7A），即可求得多糖生成動(dòng)力學(xué)模型：

根據(jù)設(shè)定發(fā)酵條件進(jìn)行灰樹花發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵過程中多糖產(chǎn)量與模擬計(jì)算如圖3、表2所示。

圖3 灰樹花真菌多糖合成模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合曲線Fig.3 The fitting curve for frondosa fungal EPS synthesis kinetics model and the experimental data

表2 灰樹花真菌發(fā)酵多糖合成模型計(jì)算值與測定值對(duì)比表Table 2 The contrast of Grifola frondosa EPS synthesis dynamic model and deter mination data

圖3、表2描述了多糖合成動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算值與測定值之間的比較，模型擬合實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的最大誤差15.83%，平均相對(duì)誤差為5.60%，說明擬合情況較好，多糖動(dòng)力學(xué)模型基本上能描述出隨發(fā)酵時(shí)間的延長多糖合成情況。

3.2.3 底物（葡萄糖）消耗動(dòng)力學(xué)

依方程（10B）條件，[s0-s-m1B（t）]對(duì)[x（t）-x0]作圖得到的直線斜率為灰樹花真菌多糖發(fā)酵過程底物糖消耗模型參數(shù)，b2=2.55，b1是根據(jù)（10A）式菌體生長處于穩(wěn)態(tài)下的b1=（ds/dt）/xm方程作圖計(jì)算得到，b1=0.24，從而獲得底物消耗的動(dòng)力學(xué)過程：

根據(jù)設(shè)定發(fā)酵條件進(jìn)行灰樹花發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵過程中底物糖變化與模擬計(jì)算擬合情況如圖4所示。

圖4 殘?zhí)窍哪Ｐ团c實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合曲線Fig.4 The fitting curve for residual sugar kinetics model and the experimental data

圖4顯示了灰樹花真菌發(fā)酵過程底物糖消耗動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較曲線，從圖中可以看出，兩者比較吻合，最大相對(duì)誤差是19.14%，而平均相對(duì)誤差為7.9%，說明模型能較好的描述灰樹花真菌發(fā)酵過程中底物糖的消耗過程。

4 結(jié)論

灰樹花真菌發(fā)酵與一般微生物多糖發(fā)酵特性類似，采用Logistic和L-P方程對(duì)灰樹花真菌發(fā)酵發(fā)酵得到了較好地理論描述，并取得了相關(guān)的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，經(jīng)研究擬合，菌體生長動(dòng)力學(xué)模型、多糖生成動(dòng)力學(xué)模型及底物糖類的消耗模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好，平均相對(duì)誤差分別為2.4%、5.60%和7.9%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)力學(xué)模型值基本相符。

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