唐 紅，董 志，曹緯國(guó)，肖曉秋，劉 媛，程玉潔，王樂(lè)樂(lè)（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016）

紅花為菊科紅花屬植物紅花（Carthamus tinctoflus L）的干燥花，夏季花由黃變紅時(shí)采摘，陰干或曬干，產(chǎn)于河南、新疆、四川等地，具有祛瘀止痛的功效。藥理研究表明，紅花黃色素具有擴(kuò)張冠脈、抗氧化、保護(hù)心肌、降血壓、免疫抑制和腦保護(hù)等255種藥理學(xué)功效。臨床上常用于冠心病、高血壓、心腦血管等疾病的預(yù)防和治療[1，2]，常以水煎液入藥。羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor Yellow A，HSYA）是一種查耳酮苷類(lèi)物質(zhì)，是紅花黃色素中含量較高的一種水溶性成分，具有藥理效應(yīng)代表性，且為單體，無(wú)明顯的毒副作用，有著極好的新藥開(kāi)發(fā)前景。筆者采用溫浸法對(duì)主要的活性物質(zhì)進(jìn)行提取、分離、純化，并對(duì)其最終含量進(jìn)行測(cè)定[3～5]。

1 儀器與試藥

UV-3150 PS（E）紫外分光光度計(jì)（日本津島公司）；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵、DT-100 A型分析天平（北京光學(xué)儀器廠）；PYXHXZ電動(dòng)振蕩器（廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；GSY-Ⅱ不銹鋼電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）。

紅花購(gòu)自重慶市藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院何先元副教授鑒定為菊科川紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花（貯藏于室溫的干燥器中）；HSYA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111637-200905，純度：91.8%）；ZTCⅡ型天然澄清劑（含A、B組分，天津天成澄清劑有限公司）；D4020、D101、D3520、AB-8、ADS-17、X-5型大孔樹(shù)脂（天津南開(kāi)大學(xué)化工廠）；聚酰胺薄膜、80～100目聚酰胺樹(shù)脂（浙江臺(tái)州四甲生化塑料廠）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅花粗提液的制備

稱(chēng)取400 g紅花藥材，第1次提取加入藥材量12倍的超純水，70℃水溫浸泡30 min，第2次提取加入10倍量的超純水，70℃水溫浸泡20 min，合并2次提取液，按1∶2比例60℃減壓濃縮，加入濃縮后藥液體積6%的ZTCⅡ型澄清劑B組分（置于70℃水浴中），絮凝30 min，再加入3%ZTCⅡ型澄清劑A組分，絮凝60 min后抽濾除去沉淀，60℃減壓濃縮至提取液含生藥1 mg·mL－1，上柱備用。

2.2 大孔樹(shù)脂分離HSYA

2.2.1 樹(shù)脂的預(yù)處理 分別將D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔樹(shù)脂置于95%乙醇中浸泡24 h，濕法裝柱，用95%乙醇洗至取流出液1mL，加4mL超純水洗至無(wú)渾濁現(xiàn)象，再用超純水洗至無(wú)醇味，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附篩選最佳樹(shù)脂型號(hào) 稱(chēng)取5.0 g預(yù)處理好的6種濕樹(shù)脂，分別加入到100mL帶塞錐型瓶中，每種樹(shù)脂稱(chēng)3份，加入10 mL粗提液，置于28℃、120 r·min－1恒溫振蕩器上振蕩24 h，吸附平衡后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法（檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；回歸方程：Y＝42.585 X－0.0287（r＝0.9999））測(cè)定吸附后溶液中HSYA含量。根據(jù)下式計(jì)算不同型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量（Q，mg·g－1）、吸附率（%）：Q＝（ρ0ν0－ρeνe/m）×100%、吸附率＝（ρ0ν0－ρeνe/ρ0ν0）×100%（式中，ρ0為吸附前溶液中HSYA的總質(zhì)量濃度；ν0為吸附前溶液總體積；ρe為吸附飽和后溶液中HSYA的總質(zhì)量濃度；νe為吸附后溶液的總體積；m為樹(shù)脂質(zhì)量）。結(jié)果，D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔樹(shù)脂的Q分別為0.3209、0.3256、0.2829、0.3147、0.3234、0.3325mg·g－1，吸附率分別為 91.8%、93.15%、81.95%、90.04%、92.55%、95.15%，X-5型大孔樹(shù)脂的Q和吸附率均較高，故選擇X-5型大孔樹(shù)脂。

2.2.3 靜態(tài)吸附篩選洗脫液濃度 將吸附液濾去，分別向達(dá)到吸附平衡的樹(shù)脂中加入30%、50%、70%的乙醇溶液（每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)），28℃下連續(xù)振搖12 h，測(cè)定此解吸液中HSYA的含量，按下式計(jì)算不同濃度的乙醇溶液的解吸附率（%）：解吸附率＝（ρdνd/ρoνo－ρeνe）×100%（式中，ρd為解吸液中的HSYA總質(zhì)量濃度；νd為解吸液體積）。結(jié)果，乙醇濃度為50%時(shí)，平均解吸附率達(dá)到了98.21%，對(duì)HSYA的洗脫效果最佳。不同濃度乙醇對(duì)HSYA解吸附的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度乙醇對(duì)HSYA解吸附的影響Fig 1 Effects of different concentration of ethonal on desorption of HSYA

2.2.4 靜態(tài)吸附篩選提取液的pH值 稱(chēng)取6份質(zhì)量為5 g的X-5型大孔樹(shù)脂，分別置于250 mL錐形瓶中，加入pH值分別為1、2、3、4、5、6的紅花粗提液（質(zhì)量濃度為0.383 mg·mL－1）各20 mL，恒溫?cái)嚢?，每? min振蕩30 s，持續(xù)2 h，然后靜置24 h，使其達(dá)到飽和吸附狀態(tài)。分別測(cè)定吸附后溶液中HSYA含量，計(jì)算不同pH值下的Q。結(jié)果，當(dāng)pH值分別為1、2、3、4、5、6時(shí)，Q分別為0.3760、0.3762、0.3831、0.3795、0.3818、0.3796 mg·g－1，當(dāng)pH值為3時(shí)的Q最大，故選擇提取液的pH值為3。

2.2.5 動(dòng)態(tài)吸附篩選不同流速 量取4份10 mL經(jīng)過(guò)預(yù)處理的X-5型大孔樹(shù)脂，分別裝入內(nèi)徑2 cm的層析柱，加入紅花粗提液5 mL，分別控制流速為1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min－1，分段收集流出液，測(cè)定流出液中HSYA含量，并計(jì)算吸附率和解吸附率。結(jié)果，流速控制在1mL·min－1時(shí)吸附率和解吸附率最佳。不同流速對(duì)HSYA吸附和解吸附的影響見(jiàn)圖2。

2.2.6 動(dòng)態(tài)吸附篩選不同徑高比 將紅花粗提液上X-5型大孔樹(shù)脂層析柱（2 cm×40 cm），上樣量固定為柱體積的2%，流速為1 mL·min－1，徑高比分別為1∶8、1∶10、1∶12，1∶15，測(cè)定HSYA的吸附率和解吸附率。結(jié)果，徑高比分別為1∶8、1∶10、1∶12、1∶15時(shí)的吸附率分別為93.3%、94.1%、94.8%、95.2%，解吸附率分別為89.7%、88.9%、93.6%、90.3%，表明徑高比為1∶12時(shí)的分離效果較好。

圖2 不同流速對(duì)HSYA吸附和解吸附的影響Fig 2 Effects of different flow rates on adsorption and desorption of HSYA

2.2.7 動(dòng)態(tài)吸附篩選上樣量 將紅花粗提液上X-5型大孔樹(shù)脂（2 cm×40 cm）層析柱，徑高比為1∶12，流速為1 mL·min－1，上樣液pH值為3，分別以1%、2%、3%、4%柱體積上樣，測(cè)定HSYA的吸附率和解吸附率。結(jié)果，上樣量分別為1%、2%、3%、4%柱體積時(shí)，吸附率分別為94.6%、95.3%、90.4%、91.2%，解吸附率分別為88.6%、92.8%、91.3%、89.7%，表明上樣量為2%時(shí)分離效果最佳。

2.2.8 大孔樹(shù)脂分離HSYA的工藝 將濃縮得到已知濃度的紅花粗提液上X-5型大孔吸附樹(shù)脂，采用2%柱體積紅花粗提液上樣，徑高比為1∶12，洗脫速度為1 mL·min－1，先用150 mL超純水洗脫，待流出液Molish反應(yīng)呈陰性時(shí)以400 mL50%乙醇洗脫，分段接取洗脫液，以HSYA為對(duì)照品進(jìn)行聚酰胺薄膜法檢視，點(diǎn)樣后以乙酸乙酯-甲醇-3.6%鹽酸（1∶3∶6）為展開(kāi)劑展開(kāi)，在紫外光燈（254 nm）下檢視。當(dāng)洗脫液在HSYA對(duì)照品熒光斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)處無(wú)斑點(diǎn)顯示時(shí)，表明HSYA成分基本洗脫完全，收集含HSYA成分的洗脫液，備用。

2.3 聚酰胺樹(shù)脂法純化HSYA

采用聚酰胺樹(shù)脂對(duì)HSYA進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，按“2.2”項(xiàng)下方法篩選得到聚酰胺樹(shù)脂純化HSYA工藝為徑高比1∶14，上樣量為2%柱體積，流速為1.5 mL·min－1，洗脫溶劑為乙酸乙酯-甲醇-3.6%鹽酸（1∶3∶6），反復(fù)上柱6次。直至樣品的主斑點(diǎn)與HSYA對(duì)照品的Rf值一致，基本無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)即可。干燥后的粉末采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定HSYA含量為83.65%。

3 討論

本研究通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)考查了不同極性、比表面積和孔徑大小的6種大孔樹(shù)脂對(duì)HSYA的吸附和解吸附效果的影響[6]，篩選出了對(duì)HSYA吸附-解吸附效果較好的X-5型大孔樹(shù)脂。非極性的X-5型大孔樹(shù)脂對(duì)HSYA的吸附可逆性好，回收率高；而非極性的D3520、D4020和ADS-17型大孔樹(shù)脂由于極性低，比表面積和平均直徑較小導(dǎo)致其對(duì)HSYA的吸附量較小；弱極性AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)HSYA吸附作用力強(qiáng)，解吸較低，不適用于對(duì)HSYA的分離及樹(shù)脂的重復(fù)利用，并增加生產(chǎn)成本。因此，最終選擇X-5型大孔樹(shù)脂對(duì)HSYA進(jìn)行分離。

ZTCⅡ型澄清劑分為A、B兩組分，它是以天然多糖等為原料制成的食品添加劑，安全無(wú)毒，澄清對(duì)象為蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、蠟質(zhì)等[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：該澄清劑使用方便，有效成分損失小。大孔樹(shù)脂是一類(lèi)有機(jī)高聚物吸附劑，是一種非凝膠型，注有致孔劑，不含交換基團(tuán)，含有“空隙”結(jié)構(gòu)的聚合物，特別適合從水溶液中分離化合物。將澄清劑法與大孔樹(shù)脂法結(jié)合，能夠降低成本，提高除雜效率。通過(guò)對(duì)影響大孔樹(shù)脂吸附與解吸附的各種因素的系統(tǒng)研究，最后選定了最佳分離、純化工藝，在此條件下得到HSYA的產(chǎn)率為25.63%，純度為83.65%。

[1]施 峰，劉焱文.紅花的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（9）：1666.

[2]張吉祥，白曉杰，周秋香，等.大孔吸附樹(shù)脂分離純化紅花黃色素的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（8）：1950.

[3]臧寶霞，王玉芹，李家實(shí)，等.分光光度法測(cè)定紅花黃色素的含量[J].藥物分析雜志，2002，22（2）：137.

[4]關(guān)穎麗，劉建宇，尹 虹.D101型大孔吸附樹(shù)脂在分離純化三萜苷方面的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2008，19（30）：2399.

[5]金 鳴，高子淳，李金榮.大孔樹(shù)脂柱色譜法制備紅花黃色素和羥基紅花黃色素A[J].中草藥，2004，35（1）：25.

[6]徐小燕，潘林梅.影響大孔樹(shù)脂吸附分離的因素及其在中藥制備工藝中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2007，18（9）：719.

[7]楊 輝，阿依吐倫·斯馬義，吳桂榮，等.羥基紅花黃色素A的提取及含量測(cè)定[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（10）：1358.