陳善源，鄧立東，徐 勤，馮樂平，黃嵐珍，于冉冉（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004）

羅漢果甜苷（Mogrosides）是一組含三萜苷元（羅漢果醇，Mogrol）和不同數(shù)目葡萄糖殘基的糖苷，為葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenorii）提取物的主要甜味成分[1]。羅漢果甜苷對(duì)四氧嘧啶復(fù)制的糖尿病模型動(dòng)物有抗氧化和控制血糖水平的作用[2]，而對(duì)正常動(dòng)物的血糖無顯著作用[3]。近年研究[4]提出胰島素抵抗導(dǎo)致的血糖血脂水平調(diào)節(jié)紊亂可使胰島B細(xì)胞處于持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，活化叉頭框蛋白-1（FOXO1）等轉(zhuǎn)錄因子，抑制葡萄糖代謝和胰島素合成，損害胰島素分泌功能并導(dǎo)致凋亡。羅漢果甜苷可能通過抗氧化作用保護(hù)胰島B細(xì)胞的胰島素分泌功能并控制糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平，但具體作用機(jī)制的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過觀察羅漢果甜苷干預(yù)棕櫚酸導(dǎo)致的胰島B細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)，初步探討羅漢果甜苷通過抗氧化作用保護(hù)胰島B細(xì)胞的機(jī)制，為今后進(jìn)一步闡明羅漢果甜苷的降血糖機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Galaxy 170 S型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司）；FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Tprofessional PCR儀（德國(guó)Biometra公司）；DYY-6D型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）；JS-780型凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）。

1.2 試藥

羅漢果甜苷（桂林萊茵生物科技股份有限公司，其中羅漢果甜苷含量為50%）；棕櫚酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；低糖Dulbecco's改良Eagle's培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Thermo Scientific公司）；0.5%含乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶與D-Hank’s溶液（美國(guó)Invitrogen公司）；二氯熒光素雙酯（DCFH-DA）法活性氧檢測(cè)試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒與2x Es Taq Mastermix PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 細(xì)胞

小鼠胰島B細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞由桂林醫(yī)學(xué)院馮樂平教授研究組惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與抗生素（100 u·mL－1青霉素和100 μg·mL－1鏈霉素）的低糖DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)瓶瓶底面積80%左右時(shí)以胰酶消化并離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按每孔30萬細(xì)胞接種至六孔板，加培養(yǎng)液至每孔總液體量為2 mL。培養(yǎng)48 h，細(xì)胞占據(jù)50%～60%培養(yǎng)孔底面積后，按表1分組，為每組更換培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。各處理組培養(yǎng)液組成見表1。

表1 各處理組培養(yǎng)液組成Tab 1 Content of cultivate medium for each group

牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1。羅漢果甜苷溶液濃度按羅漢果甜苷的含量計(jì)算為40 mmol·L－1。棕櫚酸牛血清白蛋白溶液中棕櫚酸濃度為4 mmol·L－1，牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1，溶劑均為高糖DMEM培養(yǎng)液。

各組培養(yǎng)環(huán)境中均含有9.375 g·L－1牛血清白蛋白；羅漢果甜苷對(duì)照組和干預(yù)組均含有1 mmol·L－1羅漢果甜苷；模型組和羅漢果甜苷干預(yù)組中均含有0.75 mmol·L－1棕櫚酸。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NIT-1細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）含量與凋亡率

細(xì)胞加藥處理完畢后，一部分加入適量無血清高糖DMEM培養(yǎng)液洗滌，每孔加入1 mL無血清高糖DMEM培養(yǎng)液與DCFH-DA工作液1 μL，混勻后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，孵育完畢后洗滌，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液；一部分制成細(xì)胞懸液后按FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒的操作說明對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)本處理完畢后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。DCF熒光強(qiáng)度值即可看作判斷ROS含量高低的指標(biāo)。

2.3 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)量細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體（GLUT）-2與丙酮酸激酶編碼基因相對(duì)表達(dá)水平

細(xì)胞加藥處理完畢后，以D-Hank’s平衡鹽液洗滌2次，按RNA抽提試劑盒說明操作，提取細(xì)胞中的總RNA。各樣本總RNA經(jīng)測(cè)量RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄生成各樣本的cDNA片段，再對(duì)cDNA片段進(jìn)行半定量PCR。PCR產(chǎn)物以最大電壓250 V、最大電流400 mA的參數(shù)在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀中拍攝電泳條帶照片。PCR反應(yīng)所使用的引物序列見表2。

表2 PCR反應(yīng)所使用的引物序列Tab 2 Primer sequence for PCR assay

2.4 數(shù)據(jù)處理

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)以FlowJo 7.6流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理；半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR所得電泳灰度圖片以Gel-Pro Analyzer 4分析并獲取各條帶的積分光密度值（IOD），使用IOD在Excel中求得各樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度（相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度計(jì)算公式：相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度＝目的基因條帶IOD/內(nèi)參基因條帶IOD）。上述數(shù)據(jù)匯入SPSS 11.0軟件中，使用單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 羅漢果甜苷對(duì)高脂環(huán)境中B細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組NIT-1細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著增加（P＜0.05）；羅漢果甜苷對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預(yù)組NIT-1細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著減少，表明羅漢果甜苷可顯著降低NIT-1細(xì)胞內(nèi)ROS含量，對(duì)棕櫚酸導(dǎo)致的NIT-1細(xì)胞內(nèi)ROS增加的抑制作用更為顯著。各組DCF熒光強(qiáng)度比較見表3。

表3 各組DCF熒光強(qiáng)度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

表3 各組DCF熒光強(qiáng)度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對(duì)照組羅漢果甜苷對(duì)照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組DCF熒光強(qiáng)度值190±5.20148±3.61＊490±8.33＊305±9.07＊#

3.2 羅漢果甜苷對(duì)高脂環(huán)境中B細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響

對(duì)各樣本總RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR均成功合成出PCR產(chǎn)物，分別為小鼠磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapdh的315 bp產(chǎn)物、小鼠GLUT-2編碼基因slc2a2的174 bp產(chǎn)物和小鼠丙酮酸激酶編碼基因pklr的205 bp產(chǎn)物。

與空白對(duì)照組比較，羅漢果甜苷對(duì)照組slc2a2基因相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；模型組slc2a2基因相對(duì)表達(dá)水平降低更顯著（P＜0.05），同時(shí)pklr基因相對(duì)表達(dá)水平也顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預(yù)組上述指標(biāo)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。各組糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的比較見表4；半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

表4 各組糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

表4 各組糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對(duì)照組羅漢果甜苷對(duì)照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組pklr基因相對(duì)表達(dá)水平10.87±0.160.18±0.06＊0.71±0.21＊#slc2a2基因相對(duì)表達(dá)水平10.67±0.23＊0.34±0.14＊0.87±0.15#

3.3 羅漢果甜苷對(duì)NIT-1細(xì)胞群落凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，空白對(duì)照組已有5%左右的細(xì)胞自發(fā)凋亡，培養(yǎng)環(huán)境中存在1 mmol·L－1濃度的羅漢果甜苷對(duì)NIT-1細(xì)胞群落凋亡率無顯著影響（P＞0.05）。加入0.75 mmol·L－1的棕櫚酸后，細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），羅漢果甜苷對(duì)棕櫚酸所造成的凋亡增加并無顯著抑制作用（P＞0.05）。各組凋亡率比較見表5。

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

組別空白對(duì)照組羅漢果甜苷對(duì)照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組5.79±1.445.44±0.2412.80±3.83＊16.00±4.33＊凋亡率/%

圖1 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative RTPCR assay

4 討論

本研究以高糖培養(yǎng)基和棕櫚酸模擬機(jī)體胰島素抵抗所導(dǎo)致的高血脂和血糖代謝障礙產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，結(jié)果顯示羅漢果甜苷可顯著降低在此環(huán)境中大幅上升的NIT-1細(xì)胞內(nèi)ROS含量，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]相同。正常情況下細(xì)胞無法攝取完整的分子量達(dá)1287 Da的羅漢果甜苷分子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示口服羅漢果甜苷后在血液中只能檢測(cè)到羅漢果醇等水解產(chǎn)物[5]。未水解的羅漢果甜苷能在NIT-1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗氧化作用的機(jī)制可能是通過細(xì)胞表面存在的糖苷酶進(jìn)行水解，小分子苷元進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化作用。

1分子羅漢果甜苷完全水解后可產(chǎn)生5分子葡萄糖。相當(dāng)于1 mmol·L－1羅漢果甜苷劑量的羅漢果甜苷混合物水解可生成遠(yuǎn)大于5 mmol·L－1的葡萄糖。NIT-1細(xì)胞在22.5 mmol·L－1葡萄糖的環(huán)境中培養(yǎng)48 h已有近5%的凋亡率，并隨葡萄糖濃度同步上升[6]。本研究中，羅漢果甜苷對(duì)照組的培養(yǎng)環(huán)境葡萄糖濃度可能高達(dá)30 mmol·L－1，NIT-1細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組無顯著差異，顯示羅漢果甜苷的抗氧化劑活性可保護(hù)NIT-1細(xì)胞免受高濃度葡萄糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中觀察到羅漢果甜苷可以有效清除棕櫚酸產(chǎn)生的ROS，但不能減少棕櫚酸造成的凋亡，甚至呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，這可以用“糖脂毒性”（Glucolipotoxicity）理論[7]作出解釋。高于生理水平的葡萄糖和脂類對(duì)胰島B細(xì)胞有協(xié)同損傷作用，除了產(chǎn)能代謝帶來的氧自由基損害外，還有蛋白糖基化和脂肪酸旁路代謝產(chǎn)物的毒害作用[8]參與。羅漢果甜苷的抗氧化作用只能減緩ROS產(chǎn)生的損傷作用，對(duì)其他損傷機(jī)制產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)在本研究中未見顯著影響，水解產(chǎn)生的葡萄糖和棕櫚酸產(chǎn)生協(xié)同毒害作用，使NIT-1細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)。

半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，羅漢果甜苷能促進(jìn)GLUT-2與丙酮酸激酶編碼基因的表達(dá)上升，對(duì)胰島B細(xì)胞的胰島素分泌功能起到了一定的保護(hù)作用。胰島B細(xì)胞表面的GLUT-2數(shù)目不受胰島素水平的影響，當(dāng)血糖上升時(shí)，葡萄糖自由進(jìn)入胰島B細(xì)胞內(nèi)，線粒體產(chǎn)生更多能量和ROS，促使含有胰島素的分泌顆粒移動(dòng)至胞膜并融合、釋放胰島素[9]。棕櫚酸代謝產(chǎn)生的ROS可通過激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使轉(zhuǎn)錄因子FOXO1向胞核內(nèi)遷移和活化[10]。在胰島B細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1的活化可抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和GLUT-2等多種產(chǎn)能代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)[11]，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞不能對(duì)血糖變化產(chǎn)生有效反應(yīng)，進(jìn)而影響胰島素分泌功能，這可能是胰島B細(xì)胞在高糖高脂環(huán)境下的自我保護(hù)機(jī)制。棕櫚酸導(dǎo)致NIT-1細(xì)胞GLUT-2和丙酮酸激酶編碼基因下調(diào)表達(dá)的效應(yīng)被羅漢果甜苷逆轉(zhuǎn)，表明羅漢果甜苷起到的抗氧化作用可降低NIT-1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，可能逆轉(zhuǎn)FOXO1的活化，有助于恢復(fù)胰島B細(xì)胞的正常葡萄糖代謝能力和葡萄糖刺激后胰島素分泌（GSIS）作用。

綜上所述，羅漢果甜苷可顯著減少NIT-1細(xì)胞內(nèi)因棕櫚酸代謝而上升的ROS含量，并提高被抑制的GLUT-2和丙酮酸激酶的基因表達(dá)水平。這些效應(yīng)可能由于羅漢果甜苷清除細(xì)胞內(nèi)ROS后使氧化應(yīng)激激活的FOXO1失活所致，具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

此外，胰島B細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷理論中的一個(gè)重要觀點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子FOXO1活化和胰腺十二指腸同源性蛋白1（PDX1）失活，此論點(diǎn)已有試驗(yàn)證據(jù)佐證[12]。PDX1失活可導(dǎo)致胰島素合成和胰島細(xì)胞再生分化能力下降[13]，羅漢果甜苷的抗氧化作用可能抑制FOXO1活化并使PDX1的活性恢復(fù)，保護(hù)胰島B細(xì)胞的胰島素合成功能和增生分化能力。羅漢果甜苷的三萜苷元結(jié)構(gòu)上與甾體激素的相似性亦可能與藥理作用相關(guān)。新近研究結(jié)果[14]證明此苷元有激活腺苷酸、活化蛋白激酶（AMPK）的作用，而腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）參與胰島B細(xì)胞的胰島素釋放過程和脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)[15]。這些作用與本研究所發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)之間有何相互作用均是深入研究羅漢果甜苷和其結(jié)構(gòu)相似分子對(duì)胰島B細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制的方向。

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