嚴優(yōu)芍,鐘偉健,孫 悅(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院,廣州 510006;.廣州市公安司法鑒定中心,廣州510030)
浙貝母為百合科植物浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖,具有清熱化痰、止咳、開郁、散結(jié)之功,是一種常用的化痰中藥。中醫(yī)理論認為,痰在腫瘤的形成機制中占有重要的地位,故在治療腫瘤的處方中經(jīng)常可見浙貝母的應(yīng)用?,F(xiàn)代研究表明,浙貝母具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用,其主要有效成分為生物堿[1,2]。筆者采用響應(yīng)面法對浙貝中總生物堿的超聲波提取工藝進行優(yōu)選,為進一步研究浙貝母奠定基礎(chǔ)。
UV-2450紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);SK8200LHC超聲儀(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);BP211D電子天平(德國Sartorius公司)。
浙貝母(廣東省藥材公司中藥飲片廠,批號:20101210);貝母素乙對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110751-200608);水為重蒸餾水,乙醇、鹽酸、氨水、氯仿、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、溴麝香草酚藍等試劑均為分析純。
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的貝母素乙對照品2.52 mg,置于25 mL量瓶中,加氯仿溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取浙貝母粉末5 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,加入適量75%乙醇,超聲(頻率:53 kHz)至一定時間,取出,濾過,濾液蒸干,殘渣加2%的鹽酸分次溶解,濾過,濾液用氨水調(diào)pH值為11,氯仿萃取3次,每次20 mL,合并萃取液于100 mL容量瓶中,加氯仿至刻度,搖勻,即得。
2.1.3 線性關(guān)系考察[3,4]精密吸取貝母素乙對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于分液漏斗中,分別加氯仿使成25 mL,再加pH 5.0的苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液2 mL和0.001 mol·L-1的溴麝香草酚藍溶液2 mL,強力振搖,靜置待完全分層,分取氯仿層于已加入0.25 g無水硫酸鈉(105℃干燥4 h)的25 mL干燥量瓶中,密塞,搖勻。隨行空白對照,在410 nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo),貝母素乙檢測濃度(c)為橫坐標(biāo),進行線性回歸,得回歸方程為A=0.0517+0.0311c(r=0.9996,n=5)。結(jié)果表明,貝母素乙檢測濃度在4.032~20.160 mg·L-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.1.4 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液5 mL,置分液漏斗中,按“2.1.3”項下“加氯仿使成25 mL”起操作。隨行空白對照,在410 nm波長處測定吸光度,代入回歸方程計算含量,并按下式計算總生物堿得率:總生物堿得率=[(A-0.0517)×V×N]/(0.0311×W×106)×100%。式中,A為吸光度;V為樣品溶液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);W為取樣量(g)。紫外吸收光譜見圖1。
圖1 紫外吸收光譜Fig 1 UV spectra
2.2.1 提取時間的選取 精密稱取浙貝母粉末5份,每份5 g,各加入20 mL75%乙醇,置超聲儀(功率:400 W,頻率:53 kHz)中分別處理15、30、45、60、75 min,濾過,濾液按“2.1”項下方法測定總生物堿含量,并計算總生物堿得率。結(jié)果,當(dāng)提取時間為45 min時總生物堿得率最大,之后隨提取時間增加得率反而緩慢下降,具體影響見圖2A。
圖2 各因素對浙貝母中總生物堿得率的影響Fig 2 Effects of each factor on the yield of total alkaloid from F.thunbergii
2.2.2 超聲波功率的選取 精密稱取浙貝母粉末5份,每份5 g,各加入20 mL75%乙醇,分別置超聲儀中以不同功率(頻率恒定為53 kHz)處理45 min,濾過,濾液按“2.1”項下方法測定總生物堿含量,并計算總生物堿得率。結(jié)果,總生物堿得率在超聲波功率達到400 W之前隨著功率的升高而增加,但在超聲波功率>400 W后,總生物堿得率明顯下降,具體影響見圖2B。
2.2.3 液料比 精密稱取浙貝母粉末5份,每份5 g,分別加入20、25、30、35、40 mL75%乙醇,置超聲儀(功率:400 W,頻率:53 kHz)中處理45 min,濾過,濾液按“2.1”項下方法測定總生物堿含量,并計算總生物堿得率。結(jié)果,隨著液料比的增大,總生物堿得率隨之提高。但當(dāng)液料比>6(mL∶g)時,總生物堿得率有下降趨勢。由于液料比過大,溶劑用量和下一步濃縮工藝的能耗都會增加,因此初步確定液料比為6(mL∶g),具體影響見圖2C。
通過單因素試驗可初步確定提取時間、超聲波功率、液料比3個參數(shù)的量,在此基礎(chǔ)上采用3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計法進行試驗方案設(shè)計。因素水平見表1(每個因素的低、中、高水平分別記作-1、0、1);試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表2。
表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels
表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案和結(jié)果Tab 2 Scheme and the results of Box-Behnken experiment design
方案中試驗號1~12為析因點試驗,而13~15為零點重復(fù)試驗,用于估計試驗誤差。試驗結(jié)果以總生物堿得率為響應(yīng)值,利用Design-Expert8.0.5軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到浙貝母中總生物堿得率(Y)對提取時間(A)、超聲波功率(B)和液料比(C)的二次多項回歸模型:Y=0.17+0.006A+0.007B+0.007C-0.0003AB-0.002AC-0.001BC-0.010A2-0.021B2-0.012C2(r=0.9948),表明響應(yīng)值Y的實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度。方差分析結(jié)果見表3。
表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis
由表3可知,模型整體達極顯著水平(P<0.01),失擬項不顯著,表明該二次方程模型比較顯著,該方程對試驗擬合較好,可以對不同條件下的浙貝母中總生物堿得率進行預(yù)測。A、B、C、A2、B2、C2為極顯著因素(P<0.01),它們對總生物堿得率有極顯著影響;而AB、AC、BC三項的P值均>0.05,說明各因素之間的交互作用不顯著。經(jīng)軟件優(yōu)化,當(dāng)A=0.2、B=0.2、C=0.3時,可使回歸方程中Y值最大:0.1696。通過編碼值與非編碼值之間的換算,可得浙貝母中總生物堿超聲波提取最佳工藝為提取時間48 min、超聲功率420 W、液料比6.6(mL∶g),在此條件下,總生物堿得率為0.1696%。
為檢驗?zāi)P皖A(yù)測的準確性,按上述最佳工藝進行3次平行試驗。結(jié)果,平均總生物堿得率為0.1685%,與理論預(yù)測值的相對誤差為0.65%,預(yù)測值與試驗值之間良好的擬合性證實了該模型的有效性。
現(xiàn)有文獻多采用正交設(shè)計法優(yōu)化浙貝母的提取工藝。與正交設(shè)計相比,響應(yīng)面法在試驗條件尋優(yōu)過程中,可以連續(xù)地對試驗的各個水平進行分析,而正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析。同時,響應(yīng)面法通過中心組合試驗,可研究幾種試驗因素間的交互作用,求得高精密度的回歸方程。因此,該方法在試驗設(shè)計中具有一定優(yōu)勢,目前在中藥研究中的應(yīng)用也日益廣泛。
筆者在單因素試驗的基礎(chǔ)上,將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)選浙貝母中總生物堿超聲波提取工藝,通過擬合方程得到浙貝母中總生物堿超聲提取的最佳條件;且回歸分析結(jié)果表明,回歸模型極顯著,驗證值和預(yù)測值吻合較好,說明模型預(yù)測可靠,可用于浙貝母中總生物堿超聲波提取工藝的優(yōu)選。
[1]胡凱文,陳信義.中藥活性成分抗耐藥腫瘤細胞體外篩選研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,1998,2:10.
[2]胡凱文,鄭洪霞,齊 靜,等.浙貝母堿逆轉(zhuǎn)白血病細胞多藥耐藥的研究[J].中華血液學(xué)雜志,1999,20(12):650.
[3]朱治富,李國元,趙 成.酸性染料比色法測定烏貝散中浙貝總生物堿的含量[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(3):222.
[4]劉喜綱,劉翠哲,常金花.應(yīng)用酸性染料比色法測定總生物堿的含量[J].中國藥房,2007,18(11):875.