范紅杰，王倩，馮娟，于維東，張強

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院干診科，沈陽110001）

骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作為重要的組織工程種子細胞，具有多分化潛能，有促進造血重建、免疫調節(jié)等作用，并且易于接受外源基因的轉染和表達［1］。研究表明，BMSCs能重塑受損的神經(jīng)元通路和改善神經(jīng)功能缺失，可成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的種子細胞［2］。而單純的將BMSCs移植入體內(nèi)后的低成活率使BMSCs的治療效果不盡如人意。因此，如何減少其移植后凋亡的發(fā)生、提高BMSCs在體內(nèi)的存活率是目前干細胞移植治療腦缺血亟待解決的問題。存活素（Survivin）是一個近期發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族成員，是至今發(fā)現(xiàn)分子量最小的、作用最強的凋亡抑制因子，且與細胞分裂、增殖等密切相關，有促進細胞轉化并且參與細胞的有絲分裂、血管生成等作用［3］。本實驗旨在研究Survivin基因修飾的BMSCs在離體微環(huán)境中能否延長其生存能力并探討其機制，為新的干細胞抗凋亡移植策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM低糖型細胞培養(yǎng)基，購自美國Gibco BRL公司；0.25%EDTA胰蛋白酶，購自美國Sigma公司；胎牛血清，購自美國 Gibco公司；PBS（pH7.2）、TRIZOL（Invitrogen公司）、反轉錄試劑盒，購自美國Promege公司；PCR相關試劑、限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒、瓊脂糖，均由日本TaKaRa公司提供；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術研究所。實驗動物為6～8周齡、體質量100～150 g的清潔級雄性SD大鼠10只，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物使用許可證號為SYXK（遼）2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)：取6～8周齡SD大鼠頸椎脫臼法處死，鈍性分離肌肉組織，完全暴露股骨和脛骨。從股骨和脛骨連接處小心分離，用止血鉗夾住股骨末端輕輕旋轉外拉取出股骨，立即置于裝有20 mL無血清低糖DMEM培養(yǎng)基的小燒杯中。依次取出另一側股骨和兩側的脛骨，剪去骨頭兩端的軟骨，抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基5 mL，將針頭插入骨髓腔反復沖洗，棄上清，用5 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，轉移至25 mL培養(yǎng)瓶中，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約24 h換液去除懸浮生長的細胞和死細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，并棄掉未貼壁細胞，每日觀察細胞生長狀況，待細胞融合至80%～90%開始傳代，標記至P3代。分為3組：MSC組（正常血清培養(yǎng)）、BMSC組（無血清培養(yǎng)48 h）和BMSC-Survivin組（無血清培養(yǎng)48 h）。

1.2.2 真核表達載體質粒轉染：收獲處于對數(shù)生長期的BMSCs，以5×104/孔轉種于6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細胞長至80%融合。轉染率的測定通過流式細胞儀檢測并分析未轉染組、轉染空質粒組和轉染Survivin基因組的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達率。

1.2.3 RT-PCR檢測Survivin基因表達情況：應用Primer3設計引物，以待檢測細胞的cDNA為模板，引 物 為 ：5′-ACCGCATCTACACCTTCAA-3′和5′-AGTGCTTCCTATGCTCCT CTAT-3′，擴增長度192 bp；內(nèi)參基因β-actin引物序列為5′-GTTGCGTTAC ACCCTTTCTT-3′和5′-CGAAGGCTCATCATTCAAA A-3′，擴增長度443 bp，由北京三博遠志生物工程服務有限公司合成。PCR反應條件：94℃預變性5 min，然后按 94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃ 45 s進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物取10 μL加2 μL 6×上樣緩沖液，電泳，紫外成像儀獲取圖像，軟件分析。

1.2.4 BMSCs對去血清凋亡的檢測：待檢測的細胞及對照細胞倒掉培養(yǎng)液，PBS洗后用0.25%胰酶消化1.5 min，倒掉胰酶，PBS小心洗1次，用PBS吹打1 min成細胞懸液，吸入Appendorf管，4℃、1000 r/min離心1 min，然后PBS重懸，4℃、1000 r/min離心2次，以PBS重懸后調整細胞密度至5×106/mL，加入10 mL AnnexinⅤ混勻，室溫暗處溫育染色15 min，在上機前5 min加入10 mg/L碘化丙錠（propidium iodide，PI）染液5 mL。用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比。分為3組：未轉染組、轉染空質粒組和轉染Survivin基因組。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，應用方差分析或成組t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的形態(tài)學觀察

接種初始的BMSCs為圓形，散在分布。48 h后細胞基本貼壁，并且有集落形成，進行第1次換液。換液后清除懸浮細胞，BMSCs開始貼壁生長，第7天左右細胞可鋪滿瓶底。傳代后隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞迅速增多，呈細長狀有突起為漩渦狀生長，其間分布有散在黑色顆?？赡転轲じ叫詮姷难毎?，胰蛋白酶消化傳代后逐漸消失，第3代時可見細胞以梭形為主。

2.2 流式細胞儀分析細胞的轉染率

未轉染組、轉染空質粒組和轉染Survivin基因組細胞的GFP表達率分別為1.3%、35.3%和32.8%（圖1）。

2.3 RT-PCR檢測Survivin基因表達結果

Survivin/β-actin比 值 MSC 組 、BMSC 組 和BMSC-Survivin 組分別為1.17、1.13 和1.75，Survivin基因表達量BMSC-Survivin組較MSC組和BMSC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），MSC組和BMSC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。

2.4 Survivin基因轉染對BMSC細胞凋亡的影響

去血清培養(yǎng)后BMSC組的早期凋亡率（2.84%）較 MSC 組（2.45%）升高（P<0.05）；血清培養(yǎng) 48 h后，BMSC-Survivin組（0.89%）較BMSC組的早期凋亡率降低（P<0.05），見圖3。

3 討論

關于BMSCs的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點，BMSCs具有來源廣泛、取材方便、體外分離和擴增簡便等優(yōu)點，自體移植無免疫排斥反應，避開了倫理學爭議，具有廣闊的臨床應用前景。BMSCs能轉染和長期表達外源性基因，近期已從單純的BMSCs移植發(fā)展到經(jīng)處理后再移植。但是BMSCs有其局限性，由于在體存活時間短，使其促進血管再生成、分泌營養(yǎng)因子等作用并不顯著，所以減少BMSCs的凋亡率是充分發(fā)揮干細胞潛能的關鍵。Survivin是一種凋亡抑制基因，Survivin在腫瘤組織中高表達，在分化成熟的正常組織中不表達［4］，可作用于細胞周期的G2/M期，與細胞分裂、增殖等密切相關，有促進細胞轉化并且參與細胞的有絲分裂、血管生成等作用［5］。因此，本實驗選擇Survivin作為外源基因，通過脂質體將其轉染至BMSCs，旨在發(fā)揮Survivin基因的抗凋亡作用，延長BMSCs的生存時間，使細胞治療與基因治療相結合，充分發(fā)揮治療作用。

本實驗采用國內(nèi)外主流的Annexin V/PI方法檢測凋亡早期細胞。細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別難度較大。Annexin V是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，具有易于結合到磷脂類如磷脂酰絲氨酸的特性，對磷脂酰絲氨酸有高度的親和性，因此該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸［6］。磷脂酰絲氨酸轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就已破壞。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞中，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染［7］。因此，本實驗將Annexin-V與PI匹配使用，建立一種用Annexin V在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合PI染料排除試驗，以區(qū)分凋亡早晚期的細胞以及死細胞。

實驗研究結果顯示，Survivin基因轉染后可降低大鼠BMSCs去血清培養(yǎng)后的早期凋亡率，使細胞存活時間延長。但是，其確切的機制有待于進一步的研究和證實。目前認為，Survivin抗凋亡作用的機制可能為：（1）直接抑制細胞凋亡蛋白酶導致細胞凋亡通路受阻而起到抑制凋亡的作用，這是由于它含有的BIR2功能區(qū)，可在Bcl-2的下游與caspase-3和caspase-7結合而直接抑制其活性；（2）通過抑制位于染色體同一基因簇并且編碼序列廣泛互補的效應細胞蛋白酶受體1轉錄，上調Survivin，從而減少細胞的凋亡，即Survivin與效應細胞蛋白酶受體1相互作用來調節(jié)細胞的凋亡；（3）抑制細胞色素C和caspase-8誘導的caspase的激活，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用；（4）與細胞周期調節(jié)因子CDK4結合，形成Survivin/CDK4復合物，該復合物使p21被釋放，從而使CDK4與Procaspase相互作用抑制細胞凋亡［8，9］。

此外，Liu等［10］的研究顯示轉染后的干細胞可能是由于提高干細胞的存活率和上調VEGF和bFGF保護因子的分泌來達到治療作用的，而VEGF和bFGF保護因子的升高可能是BMSCs生存時間提高的結果。如何提高治療作用的關鍵在于如何提高干細胞的生存時間，所以Survivin提高干細胞的生存時間是今后研究的重要方向，其機制需要再進一步的研究，使轉基因治療缺血性腦血管病以及其他器官疾病的治療成為可能。同時本實驗也存在一些不足之處：（1）沒有充分的證據(jù)證明BMSCs轉染后的多分化性和保護因子的高分泌，需要下一步的實驗及體內(nèi)實驗繼續(xù)研究；（2）Survivin基因轉染后增強BMSCs抗凋亡能力的確切機制仍不明確，有待于進一步研究和探討。

總之，本實驗結果提示轉染Survivin基因對BMSCs具有保護作用，可降低去血清培養(yǎng)的早期凋亡率，延長其存活時間，使解決BMSCs在體內(nèi)凋亡率高的問題有了新的突破，從而為臨床治療提供了一個新的思路。

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