王各各，李嬌娜，杜峰，鄧舒，梁佳元，曹雅明，羅恩杰

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽110001；2.沈陽市中醫(yī)藥學(xué)?；A(chǔ)教研室，沈陽110001；3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽110001）

瘧疾作為一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的感染性寄生原蟲疾病，據(jù)2011年WHO報告，2010年全球約33億人受到瘧疾的威脅，導(dǎo)致約65.5萬患者死亡［1］，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的健康危害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于瘧原蟲和傳播蚊蟲的耐藥問題［1，2］及目前尚無有效的瘧疾疫苗［3］，所以瘧疾的防治工作形勢仍然十分嚴(yán)峻。而隨著各種瘧原蟲基因序列相繼公布，基因修飾技術(shù)（genetic modification technologies）廣泛地應(yīng)用于瘧原蟲基因功能的研究，瘧原蟲生物學(xué)行為及其與宿主的關(guān)系等方面的研究，為抗瘧疫苗的研制和瘧原蟲耐藥機(jī)制研究開創(chuàng)了新途徑。對基因操縱的過程是一個繁瑣又漫長的過程，除了源于轉(zhuǎn)染效率較低外，還在于構(gòu)建一個富含AT序列的打靶載體也很費時［4］。而MultiSite Gateway技術(shù)（MultiSite Gateway technology）為構(gòu)建含有這樣序列的打靶載體提供了快速方便的方法。MultiSite Gateway克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是lambda噬菌體的位點特異性重組反應(yīng)，是一種準(zhǔn)確保存遺傳信息的有效的自然生化途徑。本方法可以使DNA片段在含有重組位點的兩質(zhì)粒間進(jìn)行定向置換，也可以用含有重組位點的DNA片段置換相應(yīng)質(zhì)粒上的片段。與傳統(tǒng)的需要DNA限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、凝膠電泳和DNA片段純化等多個步驟的單調(diào)乏味的亞克隆方法相比，該方法操作方便、快捷，節(jié)省了大量的時間和勞力。本文以構(gòu)建約氏瘧原蟲紅細(xì)胞結(jié)合樣蛋白（erythrocytebinding-likeprotein，ebl）［5］，條件性敲除基因打靶載體為例，展示該方法的實施策略、操作過程及其優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 材料

約氏瘧原蟲致死型（P.yoelii17xl）、質(zhì)粒pCHD43 （Calmodulin5′driving hDHFR，referring to the orientation of the att cassette and 4/3 for attR sites 4 and3，前期構(gòu)建包括藥物篩選基因hDHFR和基因重復(fù)reg20序列等元件）和P.bUIS4/flp［6］由長崎大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所提供，E.coliJM109和DH5α由本教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pCHD-EBL-FRT的構(gòu)建

主要應(yīng)用MultiSite Gateway方法，完成若干DNA片段的定性重組。MultiSite Gateway方法主要包括BP反應(yīng)（BP recombination reaction）和LR反應(yīng)（LR recombination reaction）。BP反應(yīng)，以attB為基礎(chǔ)（attB PCR產(chǎn)物或是表達(dá)克隆）與attP（供體）反應(yīng)后建立1個包含attL的PENT克隆。LR反應(yīng)，1個包含attL的PENT克隆與1個包含attR的目的載體反應(yīng)后建立一個包括attB的表達(dá)克隆。

1.2.1.1 獲取EBL基因同源臂

1.2.1.1.1 PCR獲取3′同源臂

以P.y17xl株基因組為模板，用分別含有F3序列、attB4位點和 SpeⅠ酶切位點、attB1位點的yEBL3UF3B4F和yEBL3USpe B1R引物（表1）擴(kuò)增3′同源臂F3-EBL3U。PCR條件為94℃2 min；98℃10 s，65 ℃30 s，68 ℃30 s，35 cys；68 ℃ 7 min。在此我們使用由FRT序列修飾而來的F3序列，代替FRT，從而防止與PyUIS4/flp質(zhì)粒單交叉法插入基因組（達(dá)到條件表達(dá)flp酶的目的）后所保留的FRT位點之間發(fā)生位點特異的重組。

1.2.1.1.25′同源臂的獲取及pB12F3-EBL5U.orf質(zhì)粒的構(gòu)建

引物 FRT-F3 PstF、FRT-F3 BamR（表1）經(jīng) 92 ℃變形72℃退火得F3片段，并把此片段連接到PstI，BamHⅠ酶切的pB12-2質(zhì)粒上得質(zhì)粒pB12F3。以P.y17xl基因組為模板，用引物yEBL5U1SpeF和yEBL5U1R（見表1）PCR 擴(kuò)增EBL.5U1（577bp）片段，條件為 94 ℃2min，98℃10 s，55 ℃30 s，68 ℃1min，35 cys；68℃7 min。用一步酶切連接法完成EBL.5U1片段和PB12F3質(zhì)粒的酶切和連接反應(yīng)，反應(yīng)體系內(nèi)同時加入StuI酶和T4連接酶，經(jīng)16℃2 h，25 ℃1h，6cys；65 ℃10 min；25 ℃過夜完成反應(yīng)。連接質(zhì)粒（PB12F3-EBL5U1）轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞。用菌落PCR鑒定后再以引物M13F/M13R測序驗證。應(yīng)用同樣步驟將PCR擴(kuò)增的EBL-5U2+EBL.orf（3285 bp）序列（引物yEBL5U2F和yEBLorf R；條件94℃2 min；98 ℃10 s，52 ℃30 s，68 ℃2min，35 cys；68 ℃7 min），以SmaI酶切位點的一步酶切連接法構(gòu)建質(zhì)粒pB12F3-EBL5U.orf，隨之轉(zhuǎn)化、菌落PCR和測序鑒定。

1.2.1.2 BP反應(yīng)獲取含有同源臂的Entry載體

PCR產(chǎn)物F3-EBL3U與載體pDonrP4P1R進(jìn)行BP反應(yīng)構(gòu)建質(zhì)粒pENT41F3-EBL3U。pB12F3-EBL5U.orf與pDonr221進(jìn)行BP反應(yīng)構(gòu)建Entry載體pENT12F3-EBL5Uorf。以上反應(yīng)均按Invitrogen說明書操作步驟進(jìn)行。

同時構(gòu)建1個含有Myc標(biāo)簽的質(zhì)粒pENT23-6Mycs?？墒怪脫Q的ebl基因C端附有Myc標(biāo)簽，方便ebl表達(dá)監(jiān)測。

1.2.1.3 LR反應(yīng)及多基因片段的組裝

將3個 Entry載 體 pENT41F3-EBL3U、pENT12F3-EBL5Uorf和pENT23-6Mycs與pCHD43進(jìn)行LR反應(yīng)，得到目的質(zhì)粒pCHD-EBL-FRT（總體構(gòu)建過程見圖1）。LR反應(yīng)按Invitrogen說明書進(jìn)行操作。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，所提質(zhì)粒用SpeⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。

1.2.2 P.yUIS4/flp質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.2.1 同源臂的獲取

以P.y17xl株基因組為模板，PCR擴(kuò)增uis4基因的5′非翻譯端作為同源臂片段（PyUIS4-5U）。并通過AT克隆構(gòu)建含有PyUIS4-5U片段的質(zhì)粒PGEM-T-PyUIS4-5U。通過位點特異突變（所用引物為表中yUIS4-5U.NhAv2R和yUIS4-5U.NhAv2F），使質(zhì)粒PGEM-T-PyUIS4-5U的PyUIS4-5U區(qū)段含有AvrⅡ和NheⅠ兩種酶切位點作為線性化位點。

1.2.2.2 同源臂的置換

用含有AvrⅡ和NheⅠ酶切位點PyUIS4-5U片段置換質(zhì)粒PbUIS4/flp同源臂（PbUIS4-5U），得約氏瘧原蟲插入質(zhì)粒PyUIS4/flp。經(jīng)SmaⅠ和NcoⅠ酶切、凝膠電泳、回收、連接等多步亞克隆完成。

2 結(jié)果

2.1 同源臂序列的測序驗證

質(zhì)粒 pENT41F3-EBL3U、PB12F3-EBL5U1、pB12F3-EBL5U.orf和pGEM-T-PyUIS4-5U經(jīng)測序顯示同源臂序列與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 質(zhì)粒酶切鑒定

2.2.1 質(zhì)粒pCHD-EBL-FRT酶切鑒定：質(zhì)粒pCHDEBL-FRT經(jīng)SpeⅠ酶切后產(chǎn)生一個11.3 kb的片段；經(jīng)PstⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段，分別為4.6 kb和6.7 kb；經(jīng)EcoRⅠ酶切后產(chǎn)生3個片段，分別為2.4 kb、3.6 kb和5.2 kb，均與預(yù)期結(jié)果完全一致（圖2）。

2.2.1 質(zhì)粒PyUIS4/flp酶切鑒定：質(zhì)粒PyUIS4/flp經(jīng)NheⅠ酶切后產(chǎn)生一個8 kb的片段；經(jīng)PstⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段，分別為2.2 kb和5.7 kb；經(jīng)XhoⅠ酶切后也產(chǎn)出兩個片段，分別為1.6 kb和6.1 kb，均與預(yù)期結(jié)果完全一致（圖3）。

3 討論

隨著反向基因技術(shù)（reverse genetic technologies）廣泛地用于瘧原蟲基因功能的研究，如何快速有效地構(gòu)建基因打靶載體越來越引起人們的重視。一個完整的傳統(tǒng)型基因打靶載體一般包括：基因組同源區(qū)長、短臂，可進(jìn)行原核及真核篩選的標(biāo)記基因，以及打靶質(zhì)粒骨架等組成部分；條件性基因敲除打靶載體除了以上的組成部分外，還需連接兩側(cè)附帶loxP或FRT位點的打靶序列。目前比較常用的基因打靶載體構(gòu)建方法是：先通過PCR擴(kuò)增各組分，然后再分別進(jìn)行酶切、連接和轉(zhuǎn)化篩選。運用這種方法，即便是最普通的傳統(tǒng)型基因敲除打靶載體也需要至少3次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng)［7］。不僅操作相對煩瑣，而且多次的體外酶切與連接反應(yīng)還增加了DNA突變的危險。

由于瘧原蟲基因組AT含量較高，使其打靶載體含有富集AT的基因片段，加之打靶載體一般較大（10 kb以上），導(dǎo)致打靶載體在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)較少并且固有的穩(wěn)定性降低［4］。因此相對其他真核細(xì)胞打靶載體構(gòu)建，瘧原蟲打靶載體的構(gòu)建更費時費力。而MultiSite Gateway技術(shù)不需要酶切和連接反應(yīng)，并且BP和LR反應(yīng)比傳統(tǒng)的連接反應(yīng)有更高的效率和特異性，還可同時進(jìn)行多個相互獨立的位點特異的重組反應(yīng)，一步即可組裝4段基因片段（1段質(zhì)粒骨干區(qū)和3段插入序列，如圖1所示），完成質(zhì)粒的構(gòu)建。比傳統(tǒng)打靶載體構(gòu)建省時省力。同時考慮可用于篩選基因修飾瘧原蟲的耐藥基因較少的情況［8，9］，把耐藥基因加入質(zhì)粒 pCHD43 內(nèi)，作為質(zhì)粒骨干區(qū)與同源臂進(jìn)行組裝，進(jìn)一步優(yōu)化了質(zhì)粒的構(gòu)建。3步即可完成瘧原蟲打靶載體的構(gòu)建：（Ⅰ）PCR獲取相應(yīng)基因的同源臂；（Ⅱ）BP重組反應(yīng)得PENT克隆；（Ⅲ）通過LR重組反應(yīng)一步完成多DNA片段的組裝。需要注意的是在第一步PCR獲取同源臂時，應(yīng)考慮后續(xù)的BP和LR反應(yīng)及構(gòu)建打靶載體的類型設(shè)計含有相應(yīng)attB位點和線性化酶切位點的引物，例如用于本實驗的5′同源臂的上游和下游引物應(yīng)分別含有attB4和attB1序列等。再次本實驗在構(gòu)建5′同源臂PENT克隆時，我們使用傳統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建方法分段分步完成質(zhì)粒的構(gòu)建，克服由較長的富含AT重復(fù)序列的5′同源臂及要加入speⅠ和F3序列所帶來的困難。由此我們看出，對于同源臂PENT克隆的構(gòu)建應(yīng)根據(jù)實驗的具體情況一步BP反應(yīng)完成（如本實驗3′同源臂PENT克隆載體的構(gòu)建）或結(jié)合其他方法分步完成（如本實驗5′同源臂PENT克隆載體的構(gòu)建）。

總之，從總體操作來看，以MultiSite gateway技術(shù)為基礎(chǔ)的體系可作為高效打靶載體的構(gòu)建工具，提高基因打靶技術(shù)研究瘧原蟲基因功能的效率。繼而我們將通過單交叉法，將PyUIS4/flp插入到UIS4基因5′非翻譯區(qū)，使flp酶能在子孢子期表達(dá)，為條件敲除目的基因提供基礎(chǔ)。再通過雙交叉法，用質(zhì)粒pCHD-EBL-FRT中含有F3序列的ebl基因置換原基因組ebl區(qū)段，從而達(dá)到條件敲除ebl基因的目的。最終為瘧原蟲與宿主的關(guān)系及減毒活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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